žinios

Taikant tradicines diagnostikos strategijas infekcinėms ligoms aptikti reikia naudoti stalinius prietaisus, kurie nėra tinkami tyrimams taške (POCT).Nauja mikrofluidika yra labai miniatiūrizuota, automatizuota ir integruota technologija, kuri yra potenciali alternatyva tradiciniams greitos, nebrangios ir tikslios diagnostikos vietoje metodams.Molekulinės diagnostikos metodai plačiai naudojami mikrofluidiniuose prietaisuose kaip efektyviausi patogenų nustatymo metodai.Šioje apžvalgoje apibendrinami naujausi mikroskystis pagrįstos infekcinių ligų molekulinės diagnostikos pasiekimai tiek akademiniu, tiek pramoniniu požiūriu.Pirma, aprašome tipišką nukleino rūgščių apdorojimą mikroschemoje, įskaitant pirminį mėginio apdorojimą, amplifikaciją ir signalo nuskaitymą.Tada palyginamos keturių tipų mikrofluidinių platformų charakteristikos, privalumai ir trūkumai.Toliau aptarsime skaitmeninių tyrimų naudojimą absoliučiam nukleorūgščių kiekiui nustatyti.Tiek klasikiniai, tiek naujausi komerciniai mikrofluidų pagrindu pagaminti molekulinės diagnostikos prietaisai yra apibendrinti kaip dabartinės rinkos būklės įrodymas.Galiausiai siūlome ateities kryptis mikrofluidinei infekcinių ligų diagnostikai.
Infekcines ligas sukelia patogenai, įskaitant bakterijas, virusus ir parazitus, kurie yra paplitę visame pasaulyje.Skirtingai nuo kitų ligų, patogenai greitai užsikrečia ir pasklinda tarp žmonių ir gyvūnų šeimininkų per inokuliaciją, oro ir vandens terpę [1].Infekcinių ligų prevencija yra labai svarbi visuomenės sveikatos priemonė.Trys pagrindinės kovos su infekcinėmis ligomis strategijos: (1) kontroliuoti infekcijos šaltinį;2) perdavimo kelio nutraukimas;3) imlių populiacijų apsauga.Tarp pagrindinių strategijų infekcijos šaltinio kontrolė laikoma svarbiausia strategija dėl jos patogumo ir mažos kainos.Greita užsikrėtusių asmenų diagnozė, izoliavimas ir gydymas yra labai svarbūs, todėl reikia greitų, jautrių ir tikslių diagnostikos strategijų [2].Dabartinė infekcinių ligų diagnostika paprastai apima klinikinį tyrimą, pagrįstą požymiais ir simptomais, ir laboratoriniais tyrimais, tokiais kaip ląstelių kultūra ir molekulinė diagnostika, kuriems reikalingas apmokytas personalas, daug darbo reikalaujančios procedūros ir brangi tyrimo įranga [3, 4].Užkrečiamųjų ligų protrūkių prevencijai reikalinga greita, nebrangi ir tiksli lokali diagnostika, ypač ribotų išteklių srityse, kur infekcinės ligos yra dažnos ir sunkios [5], taip pat gydymas dykumoje ar mūšio lauke, kur ekstremalios situacijos yra nenuspėjamos..medicininė priežiūra yra ribota [6].Šiame kontekste mikrofluidika yra technologija, apjungianti mikroelektromechaninių sistemų technologijas, nanotechnologijas ar medžiagų mokslą, kad būtų galima tiksliai manipuliuoti skysčiais [7,8,9,10], suteikiant naujų galimybių aptikti priežiūros vietą (POCT).) infekcijos sukėlėjai ne ligoninėse ir laboratorijose.Palyginti su tradicine daug laiko reikalaujančia diagnostika, mikrofluidinė technologija leidžia sutaupyti mėginių ir sutaupyti molekulinės diagnostikos išlaidų protrūkių metu.Pasaulinį koronavirusinės ligos (COVID-19) plitimą 2019 m. sukelia sunkaus ūminio kvėpavimo sindromo koronavirusas 2 (SARS-CoV-2), todėl dar kartą pabrėžiama mikrofluidikos svarba laiku prevencijai ir pandemijos kontrolei [11, 12 , 13].Skirtingai nuo tradicinės diagnostikos, mikrofluidinis POCT naudoja mažus nešiojamus prietaisus, pradedant staliniais analizatoriais ir baigiant mažomis šoninio srauto bandymo juostelėmis, kad būtų galima atlikti tyrimą netoli mėginių ėmimo vietos [14].Šie testai pasižymi supaprastintu mėginio paruošimu arba visai jo neparuošimu, greitu signalo sustiprinimu ir jautriais signalo rodmenimis, todėl per kelias minutes gaunami trumpi ir tikslūs rezultatai.Dėl mikroskysčių pagrindu pagamintų sveikatos priežiūros priemonių prieinamumo ir masinės gamybos išplėtė jų ekonomiškas ir tiesioginis diagnostikos pritaikymas ne ligoninėje, šalia paciento ir net namuose.
Tarp esamų infekcinių ligų diagnostikos strategijų molekulinė diagnostika yra viena jautriausių [15, 16].Be to, molekulinė diagnostika dažnai naudojama kaip auksinis standartas nuolatiniam COVID-19 aptikimui, leidžiantis tiesiogiai aptikti virusui specifines RNR arba DNR sritis prieš prasidedant imuniniam atsakui [17, 18].Šioje apžvalgoje pristatome naujausius mikrofluidika pagrįstų infekcinių ligų molekulinės diagnostikos procesų pasiekimus, žiūrint iš akademinės perspektyvos į ateities pramonės perspektyvas (1 pav.).Pradėsime nuo trijų pagrindinių nukleino rūgščių aptikimo etapų: pirminis mėginio apdorojimas mikroschema, nukleorūgščių amplifikacija ir signalo skaitymas.Tada palyginome skirtingų tipų mikrofluidines platformas su jų struktūra ir funkcijomis, parodydami unikalias savybes (stipriąsias ir silpnąsias puses).Skaitmeninis nukleorūgščių aptikimas toliau aptariamas ir pateikiamas kaip trečiosios kartos technologijos, skirtos absoliučiai infekcinių patogenų molekulių kiekybiniam įvertinimui, pavyzdys.Be to, bus pristatyti keli tipiški ir naujausi komerciniai POCT prietaisai, demonstruojantys dabartinę molekulinės diagnostikos mikrofluidinės POCT rinkos būklę.Taip pat aptarsime ir paaiškinsime savo ateities programų viziją.
Nukleino rūgščių aptikimo mikroskysčių lustų modulius pagal savo funkcijas galima suskirstyti į tris kategorijas (atranka, atpažinimas ir signalizacija) [19].Tarp šių modulių mėginių ėmimo modulis daugiausia realizuoja mėginių lizę ir nukleorūgščių ekstrakciją.Jutiklio modulis daugiausia kontroliuoja nukleorūgščių signalų konvertavimą ir stiprinimą.Signalizacijos modulis aptinka signalą, konvertuotą ir apdorotą jutimo modulio.Remdamiesi nukleino rūgščių aptikimo luste procesu, apibendrinsime įvairius lustus, kurie gali realizuoti „įvesties ir išvesties“ funkciją.
Pirmasis nukleino rūgščių aptikimo žingsnis yra nukleino rūgšties ekstrahavimas, ty tikslinės nukleino rūgšties išskyrimas iš pradinio mėginio.Nukleino rūgščių ekstrakcija atliekama siekiant išvalyti nukleino rūgštis nuo kitų molekulinių teršalų, užtikrinti pirminės nukleorūgščių molekulių struktūros vientisumą ir optimizuoti rezultatus.Nukleino rūgščių ekstrakcijai reikalinga būtina mėginio lizės ir nukleino rūgščių surinkimo, kurios kokybė ir efektyvumas turi didžiulę įtaką tyrimų ir diagnostikos rezultatams.Bet koks subtilus šalutinis poveikis ekstrahavimo metu gali apriboti tolesnį aptikimą.Pavyzdžiui, polimerazės grandininės reakcijos (PGR) ir kilpinės izoterminės amplifikacijos (LAMP) metodus slopina kai kurie organinių tirpiklių likučiai, tokie kaip etanolis ir izopropanolis nukleorūgščių išskyrimo reagentuose [20].Ekstrahavimas skysčiu-skysčiu ir kietosios fazės ekstrahavimas yra populiariausi nukleino rūgščių išskyrimo būdai [21], tačiau skysčių-skysčių ekstrahavimas ant lusto yra labai ribotas, nes skystis-skysčio ekstrakcijai naudojami reagentai sukelia daugumos mikroskysčių lustų koroziją. .Čia išryškiname mikrogardelių pagrindu sukurtus kietosios fazės ekstrahavimo metodus ir palyginame jų privalumus ir trūkumus.
Silicis yra substratinė medžiaga, suderinama su nukleino rūgštimis dėl savo biologinio suderinamumo, stabilumo ir lengvo modifikavimo [22].Svarbu tai, kad modifikuotas silicio dioksidu ar kitomis medžiagomis, šis kompozitas pasižymi savybėmis adsorbuoti neigiamo krūvio nukleino rūgštis esant žemam pH, didelės druskos sąlygomis, eliuuojant aukšto pH ir mažai druskos turinčiais tirpalais.Remiantis šiuo reiškiniu, galima išvalyti nukleino rūgštį.
Nukleino rūgščių ekstrahavimui mikrofluidikoje buvo naudojamos įvairios silicio dioksido pagrindu pagamintos medžiagos, tokios kaip silicio granulės, milteliai, mikropluošto filtrai ir silicio dioksido membranos [23, 24, 25, 26].Priklausomai nuo medžiagos savybių, silicio pagrindu pagamintos medžiagos gali būti naudojamos mikroschemose įvairiais būdais.Pavyzdžiui, silicio dioksido granules, miltelius ir komercinius nanofiltrus galima tiesiog įdėti į mikroskysčių lustų poras arba mikrokanalus ir padėti iš mėginių išgauti nukleino rūgštis [27, 28, 29].Paviršiuje modifikuotos silicio dioksido membranos taip pat gali būti naudojamos greitai išvalyti DNR nuo patogenų už mažą kainą.Pavyzdžiui, Wang ir kt.[30] Derinant denatūravimo amplifikacijos reakcijas su pūslelių sukeltu grandinės mainu su silicio dioksido membranomis, padengtomis chitozano oligosacharidais, buvo įdiegta universali nešiojama sistema, kuri sėkmingai aptiko 102–108 kolonijas formuojančius vienetus.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., o viruso buvimas buvo lengvai matomas.Powell ir kt.[31] Tada silicio pagrindu pagamintos mikroschemos buvo naudojamos hepatito C virusui (HCV), žmogaus imunodeficito virusui (ŽIV), Zikos virusui ir žmogaus papilomos virusui aptikti bei automatiniam dauginimui, kuriame buvo sukurtas 1,3 μl vingiuotas mikroreaktorius RNR virusams užfiksuoti.ir atlikti in situ stiprinimą.Be šių metodų, paviršiuje modifikuoto silicio dioksido mikrokolonėlės taip pat atlieka pagrindinį vaidmenį ekstrahuojant nukleorūgštis, nes modifikuojančios medžiagos geometrija ir savybės labai padidina ekstrahavimo efektyvumą.Chen ir kt.[32] pasiūlė mikrofluidinę platformą mažos koncentracijos RNR izoliacijai, pagrįstą aminosluoksne dengtomis silicio mikrokolonėlėmis.Šis mikrofluidinis prietaisas sujungia 0,25 cm2 mikrostulpelių masyvą ant silicio pagrindo, kad būtų pasiektas didesnis ekstrahavimo efektyvumas dėl didelio paviršiaus ploto ir tūrio santykio.Šios konstrukcijos pranašumas yra tas, kad mikrofluidinis prietaisas gali pasiekti iki 95% nukleorūgščių ekstrahavimo efektyvumą.Šios silicio pagrindu sukurtos strategijos parodo greitai išskiriamų nukleino rūgščių vertę mažomis sąnaudomis.Kartu su mikrofluidiniais lustais silicio pagrindu sukurtos ekstrahavimo strategijos gali ne tik padidinti nukleorūgščių aptikimo efektyvumą, bet ir palengvinti analitinių prietaisų miniatiūrizavimą ir integravimą [20].
Magnetinio atskyrimo metodai naudoja magnetines daleles nukleino rūgštims išskirti esant išoriniam magnetiniam laukui.Dažniausiai naudojamos magnetinės dalelės apima Fe3O4 arba γ-Fe2O3 magnetines daleles, padengtas silicio dioksidu, amino ir karboksilu [33,34,35,36].Magnetinių dalelių skiriamasis bruožas, palyginti su silicio pagrindu pagamintais SPE metodais, yra paprastas manipuliavimas ir valdymas išoriniais magnetais.
Naudojant elektrostatinę sąveiką tarp nukleino rūgščių ir silicio dioksido, esant dideliam druskos kiekiui ir žemam pH, nukleino rūgštys adsorbuojamos ant silicio dioksidu dengtų magnetinių dalelių paviršiaus, o esant mažai druskai ir aukštam pH, molekules galima nuplauti. vėl..Silicio dioksidu padengtos magnetinės granulės leidžia išskirti DNR iš didelio tūrio mėginių (400 μL), naudojant magnetiniu būdu valdomus judesius [37].Kaip demonstraciją, Rodriguez-Mateos ir kt.[38] naudojo derinamus magnetus, kad kontroliuotų magnetinių karoliukų perkėlimą į skirtingas kameras.Remiantis silicio dioksidu padengtomis magnetinėmis dalelėmis, iš nuotekų mėginių galima išskirti 470 kopijų/ml SARS-CoV-2 genominės RNR LAMP atvirkštinės transkripcijos aptikimui (RT-LAMP), o atsaką galima nuskaityti per 1 valandą.plika akimi (2a pav.).
Prietaisai, pagaminti iš magnetinių ir akytų medžiagų.IFAST RT-LAMP mikrofluidinio prietaiso, skirto SARS-CoV-2 RNR aptikti, koncepcinė schema (pritaikyta iš [38]).b Išcentrinis mikro prietaisas, skirtas žandinio tampono nukleino rūgšties dSPE (pritaikytas iš [39]).c Integruotas savarankiškai maitinamas mėginių koncentratorius, naudojant FTA® kortelę (pritaikytas iš [50]).d Fusion 5 filtravimo popierius, modifikuotas chitozanu (pritaikytas iš [51]).SARS-CoV-2 sunkus ūminis respiracinis sindromas koronavirusas 2, RT-LAMP atvirkštinės transkripcijos kilpa tarpininkaujama izoterminė amplifikacija, FTA Finders technologijos partneriai, NA nukleorūgštis
Teigiamai įkrautos magnetinės dalelės idealiai tinka pritvirtinti nukleorūgšties fosfatinį pagrindą.Esant tam tikrai druskos koncentracijai, neigiamai įkrautos nukleorūgščių fosfatinės grupės gali būti teigiamai įkrautos magnetinių kompozitinių dalelių paviršiuje.Todėl nukleorūgščių ekstrakcijai buvo sukurtos magnetinės nanodalelės, turinčios grubų paviršių ir didelį amino grupių tankį.Po magnetinio atskyrimo ir blokavimo magnetinės nanodalelės ir DNR kompleksai gali būti tiesiogiai naudojami PGR, todėl nereikia atlikti sudėtingų ir daug laiko reikalaujančių gryninimo ir eliuavimo operacijų [35].Magnetinės nanodalelės, padengtos neigiamomis karboksilo grupėmis, taip pat buvo naudojamos atskirti nukleino rūgštis, adsorbuotas ant paviršių didelės koncentracijos polietilenglikolio ir natrio chlorido tirpaluose [36].Naudojant šiuos paviršiaus modifikuotus magnetinius rutuliukus, DNR ekstrahavimas yra suderinamas su vėlesniu amplifikavimu.Dignan ir kt.[39] aprašė automatizuotą ir nešiojamą išcentrinę mikrofluidinę platformą, skirtą išankstiniam nukleino rūgščių apdorojimui, leidžiančią netechniniam personalui ją naudoti vietoje.Be to, išskirtos DNR suderinamumas su LAMP – metodu, puikiai tinkančiu nukleorūgščių analizei priežiūros taške – dar labiau parodo minimalius įrangos reikalavimus ir tinkamumą kolorimetriniams tyrimams (2b pav.).
Magnetinių granulių metodai suteikia galimybę automatizuoti ekstrahavimą, kai kurie iš jų egzistuoja komerciniuose automatizuotuose nukleorūgščių ekstraktoriuose [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, JAV), QIAcube® HT;CapitalBio (Pekinas, Kinija) ir Biomek®;Beckmanas (Miami, JAV).), Florida, JAV)].Magnetinių granulių sujungimo su mikrofluidika privalumus galima panaudoti efektyviai automatizuotai nukleorūgščių ekstrakcijai, o tai potencialiai gali paskatinti molekulinės diagnostikos plėtrą;Tačiau magnetinių granulių ir mikrofluidikų derinys vis dar labai priklauso nuo sudėtingų valdymo sistemų, skirtų tiksliai manipuliuoti magnetinėmis granulėmis, o tai paaiškina komercinių produktų populiarumą, nes jie yra dideli ir brangūs, o tai riboja tolesnį magnetinių karoliukų naudojimą POCT.
Nukleino rūgštims aptikti taip pat buvo naudojamos kelios porėtos medžiagos, tokios kaip modifikuoti nitroceliuliozės filtrai, Finders Technology Associates (FTA) kortelės, polietersulfono pagrindu pagamintas filtravimo popierius ir glikanu dengtos medžiagos [40, 41, 42, 43, 44].Poringos pluoštinės medžiagos, tokios kaip pluoštinis popierius, pirmiausia buvo naudojamos DNR izoliuoti, fiziškai supainiojus ilgasriegias DNR molekules pluoštais.Mažos poros lemia stiprų fizinį DNR molekulių apribojimą, o tai teigiamai veikia DNR išskyrimą.Dėl skirtingų pluoštinio popieriaus porų dydžių ekstrahavimo efektyvumas negali patenkinti DNR amplifikacijos poreikių [45, 46].FTA kortelė yra komercinis filtravimo popierius, naudojamas teismo medicinos srityje ir plačiai naudojamas kitose molekulinės diagnostikos srityse.Naudojant celiuliozės filtravimo popierių, impregnuotą įvairiomis cheminėmis medžiagomis mėginio ląstelių membranoms lizuoti, išsiskyrusi DNR yra apsaugota nuo skilimo iki 2 metų.Visai neseniai buvo sukurtas impregnuotas celiuliozinis popierius, skirtas molekuliniu būdu aptikti įvairius patogenus, įskaitant SARS-CoV-2, leišmaniozę ir maliariją [47, 48, 49].Išskirtoje plazmoje esantis ŽIV lizuojamas tiesiogiai, o virusinė nukleorūgštis yra praturtinta koncentratoriuje įmontuotoje FTA® srauto membranoje, kuri leidžia efektyviai gaminti nukleino rūgštį [50] (2c pav.).Pagrindinė nukleino rūgščių aptikimo naudojant LPS korteles problema yra ta, kad cheminės medžiagos, tokios kaip guanidinas ir izopropanolis, slopina vėlesnes amplifikacijos reakcijas.Norėdami išspręsti šią problemą, sukūrėme Fusion 5 chitozanu modifikuotą filtravimo popierių, kuris apjungia tiek fizinio DNR molekulių ir pluoštinio filtravimo popieriaus, tiek elektrostatinės DNR adsorbcijos ant chitozanu modifikuotų junginių privalumus, kad būtų pasiektas labai efektyvus nukleorūgščių ekstrahavimas. ..filtro pluoštai [51] (2d pav.).Panašiai Zhu ir kt.[52] pademonstravo chitozanu modifikuotą PGR metodą, pagrįstą in situ kapiliarine mikrofluidine sistema, skirta greitai išskirti ir aptikti Zikos viruso RNR.Nukleino rūgštys gali būti atitinkamai adsorbuojamos / desorbuojamos mišrioje lizato / PGR terpėje, atsižvelgiant į chitozano įjungimo / išjungimo jungiklio savybę.įjungti ir išjungti“, reaguoja į pH.
Kaip minėta aukščiau, šios strategijos sujungia įvairių kietosios fazės medžiagų privalumus ir padidina nukleorūgščių ekstrahavimo mikrofluidikoje efektyvumą.Praktikoje šių medžiagų naudojimas dideliais kiekiais yra neekonomiškas, o tinkamas paviršiaus apdorojimas arba įprastų medžiagų paviršiaus modifikavimas šiomis medžiagomis taip pat gali išsaugoti jų funkciją.Todėl manoma, kad šių strategijų įgyvendinimas po bandomojo tyrimo gali sumažinti išlaidas.
Nukleino rūgščių tyrimams mikrofluidinėse platformose dažnai naudojami nedideli mėginio tūriai (< 100 µl), todėl tikslines nukleino rūgštis reikia amplifikuoti specialiais zondais, kad būtų galima konvertuoti į signalą, kuris yra patogus aptikti pasroviui (optinis, elektrinis ir magnetinis) [53, 54]. Nukleino rūgščių tyrimams mikrofluidinėse platformose dažnai naudojami nedideli mėginio tūriai (< 100 µl), todėl tikslines nukleino rūgštis reikia amplifikuoti specialiais zondais, kad būtų galima konvertuoti į signalą, kuris yra patogus aptikti pasroviui (optinis, elektrinis ir magnetinis) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Tiriant nukleino rūgštis mikrofluidinėse platformose, dažnai naudojami nedideli mėginio tūriai (<100 µL), todėl tikslines nukleino rūgštis reikia amplifikuoti specialiais zondais, kad jie būtų paverčiami signalu, patogiu tolesniam aptikimui (optiniu, elektriniu ir magnetiniu). [53, 54].微流控平台上的核酸检测通常使用小样本量（< 100 µl），因此需要使用特定探针扩增目标核酸，以转换为便于下游检测（光学、电学和磁学）的信号[53, 54 ].微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 需要 特定 探针 扩增 目标 ， 以 转换 为 下游 下游 （光学 、 电学 磁学） 的 信号 [53, 54, 54, 54 ]. Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. Nukleino rūgščių aptikimui mikrofluidinėse platformose paprastai naudojami nedideli mėginio tūriai (<100 μl), todėl tikslines nukleino rūgštis reikia amplifikuoti specialiais zondais, kad jos būtų paverstos signalais tolesniam aptikimui (optiniu, elektriniu ir magnetiniu) [53, 54]] .Nukleino rūgščių amplifikacija mikrofluidikoje taip pat gali pagreitinti reakcijas, optimizuoti aptikimo ribas, sumažinti mėginių poreikį ir pagerinti aptikimo tikslumą [55, 56].Pastaraisiais metais, įgyvendinant greitą ir tikslų aptikimą, mikrofluidikoje buvo taikomi įvairūs nukleorūgščių amplifikacijos metodai, įskaitant PGR ir kai kurias izotermines amplifikacijos reakcijas.Šiame skyriuje bus apibendrinti nukleorūgščių aptikimo metodai, pagrįsti mikrofluidinėmis sistemomis.
PGR – tai organizmo DNR replikacijos proceso modeliavimas, kurio teorija detaliai aprašyta kitur ir čia nebus aptariama.PGR gali amplifikuoti labai nedidelį tikslinės DNR/RNR kiekį eksponentiniu greičiu, todėl PGR yra galingas įrankis greitam nukleino rūgščių aptikimui.Pastaraisiais dešimtmečiais buvo sukurta daug nešiojamų mikrofluidinių prietaisų su PGR terminio ciklo sistemomis, kad atitiktų diagnostikos taškuose poreikius [57, 58].Mikroschemos PGR galima suskirstyti į keturis tipus (įprastinis, nuolatinis srautas, erdvinis perjungimas ir konvekcinis PGR) pagal skirtingus temperatūros kontrolės metodus [59].Pavyzdžiui, Gee ir kt.[60] sukūrė tiesioginės atvirkštinės transkripcijos kiekybinės PGR (RT-qPCR) metodą savo mikrofluidinėje platformoje, skirtą SARS-CoV-2, gripo A ir B virusų multipleksiniam aptikimui gerklės tepinėlių mėginiuose (3a pav.).Park ir kt.[61] sukūrė paprastą patogenų analizės lustą, integruodamas plonasluoksnį PGR, elektrodus ir pirštu valdomą polidimetilsiloksano pagrindu pagamintą mikrofluidinį modulį.Tačiau abu darbai įkūnija bendrus įprastinio PGR trūkumus.PGR reikalingas terminis ciklas, o tai riboja tolesnį įrenginio miniatiūrizavimą ir sumažina bandymo laiką.
Norint išspręsti šią problemą, labai svarbu sukurti nuolatinį srautą pagrįstą mikrofluidinį ir erdvėje perjungiamą PGR.Naudojant ilgą serpentininį kanalą arba trumpą tiesų kanalą, nuolatinio srauto PGR gali užtikrinti greitą amplifikaciją, aktyviai cirkuliuojant reagentus trijose išankstinio pašildymo zonose su išjungtu lustu.Ši operacija sėkmingai leidžia išvengti pereinamojo laikotarpio tarp skirtingų reakcijos temperatūrų fazės ir taip žymiai sutrumpina bandymo laiką [62] (3b pav.).Kitame Jung ir kt. tyrime.[63] pasiūlė naują rotacinį PGR genetinį analizatorių, kuris apjungia fiksuoto ir srautinio PGR charakteristikas, skirtas ultragreitai ir daugkartinei atvirkštinei transkripcijai PGR (3c pav.).Nukleino rūgščių amplifikacijai PGR mikroschema bus sukama per tris kaitinimo blokus skirtingomis temperatūromis: 1. Denatūravimo blokas 94°C, 2. Atkaitinimo blokas 58°C temperatūroje, 3. Išsiplėtimo blokas 72°C temperatūroje.
PGR taikymas mikrofluidikoje.Scheminis dirRT-qPCR vaizdas mikrofluidinėje platformoje (pritaikytas iš [60]).b Scheminis nepertraukiamo srauto PGR mikromatricos, pagrįstos serpentininiu kanalu, vaizdavimas (pritaikytas iš [62]).c Sukamojo PGR genetinio analizatoriaus, susidedančio iš mikroschemos, trijų šildymo blokų ir žingsninio variklio, schema (pritaikyta iš [63]).d Termokonvekcijos PGR diagrama su centrifugavimu ir nustatymu (pritaikyta iš [64]).DirRT-qPCR, tiesioginė kiekybinė atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija
Naudojant kapiliarus ir kilpas ar net plonas plokšteles, konvekcinė PGR gali greitai amplifikuoti nukleino rūgštis natūralia laisva termine konvekcija, nereikalaujant išorinio siurblio.Pavyzdžiui, ciklinė olefino polimero mikrofluidinė platforma buvo sukurta pagamintoje besisukančioje kaitinimo stadijoje, kurioje naudojamas terminis ciklas su centrifugavimu PGR kilpos mikrokanale [64] (3d pav.).Reakcijos tirpalą skatina šiluminė konvekcija, kuri žiedinės struktūros mikrokanaluose nuolat keičia aukštą ir žemą temperatūrą.Visą stiprinimo procesą galima užbaigti per 10 minučių, kai aptikimo riba yra 70,5 pg/kanalas.
Kaip ir tikėtasi, greitas PGR yra galingas įrankis, skirtas visiškai integruotoms mėginio atsako molekulinės diagnostikos ir multipleksinės analizės sistemoms.Greitoji PGR žymiai sumažina laiką, reikalingą SARS-CoV-2 aptikti, o tai padeda veiksmingai kontroliuoti COVID-19 pandemiją.
PGR reikia sudėtingo terminio ciklo, kuris netinka POCT.Visai neseniai izoterminės amplifikacijos metodai buvo taikomi mikrofluidikai, įskaitant, bet neapsiribojant, LAMP, rekombinazės polimerazės amplifikaciją (RPA) ir amplifikaciją, pagrįstą nukleorūgščių sekomis [65, 66, 67, 68].Taikant šiuos metodus, nukleino rūgštys amplifikuojamos esant pastoviai temperatūrai, o tai palengvina pigių, labai jautrių nešiojamų POCT prietaisų, skirtų molekulinei diagnostikai, sukūrimą.
Didelio našumo mikrofluidika pagrįsti LAMP tyrimai leidžia daug kartų aptikti infekcines ligas [42, 69, 70, 71].Kartu su išcentrine mikrofluidine sistema LAMP gali dar labiau palengvinti nukleorūgščių aptikimo automatizavimą [69, 72, 73, 74, 75].Sukasi ir reaguoja SlipChip, skirtas vizualiai aptikti kelias lygiagrečias bakterijas naudojant LAMP [76] (4a pav.).Naudojant optimizuotą LAMP tyrime, fluorescencijos signalo ir triukšmo santykis buvo maždaug 5 kartus didesnis, o aptikimo riba siekė 7,2 kopijos/μl genominės DNR. Be to, remiantis metodu per < 60 min., buvo vizualizuoti penki įprasti virškinimo bakterijų patogenai, įskaitant Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis ir Vibrio parahaemolyticus. Be to, remiantis metodu per < 60 min., buvo vizualizuoti penki įprasti virškinimo bakterijų patogenai, įskaitant Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis ir Vibrio parahaemolyticus.Be to, naudojant šį metodą per mažiau nei 60 minučių buvo vizualizuotas penkių įprastų virškinamojo trakto bakterijų patogenų, įskaitant Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis ir Vibrio parahaemolyticus, buvimas.此外，基于该方法在<60分钟内可视化了五种常见消化道细菌病原体的存在，包括蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌、肠沙门氏菌、河流弧菌和副溶血性弧菌。此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 氏 菌 、 弧菌 和 副溶血性。。。 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPBe to, naudojant šį metodą per mažiau nei 60 minučių buvo vizualizuotas penkių bendrų bakterinių virškinimo trakto patogenų, įskaitant Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius ir Vibrio parahaemolyticus, buvimas.
LAMP privalumai mikrofluidikoje, be kitų, yra greitas atsakas ir miniatiūrinis aptikimas.Tačiau dėl reakcijos temperatūros (apie 70 °C) LAMP metu neišvengiamai susidaro aerozoliai, todėl gaunamas didelis klaidingai teigiamų rezultatų rodiklis.LAMP taip pat reikia optimizuoti tyrimo specifiškumą, pradmenų dizainą ir temperatūros kontrolę.Be to, lustų dizainas, įgyvendinantis kelių taikinių aptikimą viename luste, yra labai vertingas ir turėtų būti plėtojamas.Be to, LAMP tinka daugiafunkciam aptikimui, integruotam į vieną lustą, o tai yra labai svarbu, tačiau dar yra daug kur tobulėti.
Didelis klaidingai teigiamas LAMP greitis gali būti iš dalies sumažintas naudojant RPA, nes dėl santykinai žemos reakcijos temperatūros (~37 °C) kyla palyginti nedaug garavimo problemų [77].RPA sistemoje du priešingi pradmenys inicijuoja DNR sintezę, prisijungdami prie rekombinazės ir amplifikacija gali būti baigta per 10 minučių [78, 79, 80, 81].Todėl visas RPA procesas yra daug greitesnis nei PGR ar LAMP.Pastaraisiais metais buvo įrodyta, kad mikrofluidinė technologija dar labiau pagerino RPA greitį ir tikslumą [82,83,84].Pavyzdžiui, Liu ir kt.[85] sukūrė mikrofluidinį integruotą šoninio srauto polimerazės rekombinazės amplifikacijos tyrimą, skirtą greitai ir jautriai aptikti SARS-CoV-2, integruojant atvirkštinės transkripcijos RPA (RT-RPA) ir universalią šoninio srauto bandymo juostelių aptikimo sistemą.į vieną mikrofluidinę sistemą.4b pav.).Aptikimo riba yra 1 kopija/µl arba 30 kopijų/mėginys, o aptikimas gali būti baigtas maždaug per 30 minučių.Kongas ir kt.sukūrė nešiojamą mikrofluidinį prietaisą.[86] naudojo kūno temperatūrą ir mobiliuoju telefonu pagrįstą fluorescencijos aptikimo sistemą, kad greitai ir tiesiogiai aptiktų ŽIV-1 DNR naudojant RPA (4c pav.).Nešiojamasis RPA tyrimas aptinka 100 kopijų/ml tikslinės sekos per 24 minutes, o tai rodo didelį potencialą greitai diagnozuoti ŽIV-1 užsikrėtusius kūdikius ribotais ištekliais.
Izoterminis stiprinimas atliekant testavimą priežiūros vietoje (POCT).Sukimo ir reakcijos SlipChip kūrimas ir gamyba.Po plazminio suvirinimo viršutinė ir apatinė lustai buvo surinkti veržlių rinkiniu, kad būtų suformuota galutinė lustas (pritaikyta iš [76]).b COVID-19 aptikimo sistemos MI-IF-RPA schema (pritaikyta iš [85]).c Nešiojamo RPA testo, skirto greitai aptikti ŽIV-1 DNR, schema (pritaikyta iš [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM karboksifluoresceinas, žmogaus imunodeficito virusas ŽIV, RPA rekombinazės polimerazės amplifikacija, LED šviesos diodas, MI-IF-RPA rekombinantinė La Microfluidics Pomerase-Flycom Stiprinimas
Mikrofluidiniu pagrindu pagaminta RPA sparčiai vystosi, tačiau lustų gamybos ir reakcijos sąnaudos yra per didelės ir turi būti sumažintos, kad būtų padidintas šios technologijos prieinamumas.Be to, didelis RPA jautrumas gali turėti įtakos nespecifinių produktų stiprinimui, ypač esant užterštumui.Šie apribojimai gali turėti įtakos RPA taikymui mikrofluidinėse sistemose ir nusipelno tolesnio optimizavimo.Norint pagerinti RPA pagrįstų mikrofluidinių strategijų įgyvendinamumą POCT, taip pat reikalingi gerai suprojektuoti pradmenys ir zondai įvairiems taikiniams.
Cas13 ir Cas12a turi galimybę atsitiktinai suskaidyti nukleino rūgštis, todėl gali būti sukurtos kaip aptikimo ir diagnostikos priemonės.Cas13 ir Cas12a aktyvuojami atitinkamai prisijungus prie tikslinės DNR arba RNR.Suaktyvintas baltymas pradeda skaidyti kitas netoliese esančias nukleino rūgštis, o po to nukreipiančios RNR, nukreipiančios į patogenui specifines nukleorūgštis, gali suskaldyti užgesintus fluorescencinius zondus ir išlaisvinti fluorescenciją.Remdamiesi šia teorija, Kellner ir kt.[87] sukūrė Cas13 pagrįstą metodą [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking (SHERLOCK)], o Broughton ir kt.[88] sukūrė kitą metodą, pagrįstą Cas12a [CRISPR Trans Reporter, nukreipiantis į DNR endonukleazę (DTECR)].
Pastaraisiais metais atsirado įvairių nukleorūgščių aptikimo metodų, pagrįstų CRISPR [89, 90].Įprasti CRISPR pagrįsti metodai dažnai yra daug laiko ir daug darbo reikalaujantys dėl daugybės procedūrų, įskaitant nukleorūgščių ekstrakciją, amplifikaciją ir CRISPR aptikimą.Skysčių sąlytis su oru gali padidinti klaidingų teigiamų rezultatų tikimybę.Atsižvelgiant į tai, kas išdėstyta pirmiau, CRISPR pagrįstas sistemas labai reikia optimizuoti.
CRISPR-Cas12a ir CRISPR-Cas13a aptikimo programoms buvo sukurta pneumatiniu būdu valdoma mikrofluidinė platforma, galinti lygiagrečiai atlikti 24 analizes [91].Sistema aprūpinta fluorescencijos aptikimo įrenginiu, kuris apeina nukleorūgščių amplifikaciją ir automatiškai aptinka femtomolinius DNR ir RNR mėginius.Chen ir kt.[92] integruota rekombinazės amplifikacija su CRISPR-Cas12a sistema išcentrinėje mikrofluidikoje (5a pav.).Šis darbas įveikia šių dviejų procesų integravimo sunkumus, nes Cas12a gali virškinti pasiuntinio DNR ir slopinti amplifikacijos procesą.Be to, Chen ir kt.[92] papildomai iš anksto saugojo reakcijos reagentus išcentriniame mikrofluidiniame valdiklyje, kad automatiškai užbaigtų visą procesą.Kitame darbe Silva ir kt.[93] sukūrė diagnostikos metodą be CRISPR/Cas12a stiprinimo ir išmanųjį telefoną SARS-CoV-2 aptikimui (5b pav.).Šis tyrimas, žinomas kaip mobiliuoju telefonu pagrįsta amplifikacijos sistema, apima nuo CRISPR / Cas priklausomą fermentą, kuris yra pagrįstas išmaniojo telefono katalazės generuojamų burbulų signalų vizualizavimu mikrofluidiniuose kanaluose.Jautrus mažiau nei 50 kopijų/µl nukleorūgšties aptikimas be išankstinio amplifikacijos, visas procesas nuo mėginio injekcijos iki signalo nuskaitymo trunka tik 71 minutę.
Nukleino rūgščių aptikimo metodai, pagrįsti CRISPR.Išcentrinis POCT skirtas integruotai molekulinei diagnostikai, pagrįstai CRISPR (pritaikytas iš [92]).b CASCADE testo, skirto SARS-CoV-2 analizei išmaniajame telefone, sukūrimas (pritaikytas iš [93]).RAA rekombinazės amplifikacija, šalia PAM esantis protospacer motyvas, CRISPR sugrupuoti trumpi palindrominiai pasikartojimai reguliariais intervalais, CASCADE sistema be mobiliojo telefono amplifikacijos su CRISPR/CAS priklausomais fermentais, 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]karbodiimido hidrochloridas EDC
Kaip paskutinis nukleino rūgščių aptikimo žingsnis, signalo aptikimas tiesiogiai atspindi diagnostikos rezultatus ir yra svarbus veiksnys kuriant efektyvų, jautrų ir tikslų POCT.Signalus galima nuskaityti naudojant įvairius metodus, tokius kaip fluorescencinė, elektrocheminė, kolorimetrinė ir magnetinė strategija.Šiame skyriuje aprašome kiekvieno požiūrio pagrindimą ir palyginame infekcinių ligų molekulinę diagnostiką mikrofluidikoje.
Fluorescencija pagrįstos strategijos yra plačiai naudojamos infekcinių ligų POCT diagnostikai dėl puikių pranašumų – puikaus jautrumo, mažų sąnaudų, naudojimo paprastumo ir priežiūros taškų analizės [94, 95].Šios strategijos naudoja žymėtus fluoroforus, tokius kaip fluorescenciniai dažai ir nanomedžiagos, kad būtų sukurtas aptinkamas signalas (fluorescencijos stiprinimas arba gesinimas).Šis atradimas rodo, kad fluorescencija pagrįstas strategijas galima suskirstyti į tiesioginį fluorescencinį žymėjimą, signalo įjungimą ir signalo išjungimą [96].Tiesioginis fluorescencinis žymenų aptikimas naudoja specialias fluorescencines etiketes, skirtas pažymėti specifinius ligandus, kurie, selektyviai surišdami su taikiniu, generuoja tam tikrą fluorescencijos kiekį.Signalais pagrįsto fluorescencijos aptikimo atveju fluorescencinio signalo kokybė yra teigiamai susijusi su dominančiu dydžiu.Fluorescencijos intensyvumas yra nereikšmingas, jei nėra taikinio, ir yra aptinkamas, kai yra pakankamas taikinio kiekis.Ir atvirkščiai, fluorescencijos intensyvumas, aptiktas „signalo išjungimo“ fluorescencija, yra atvirkščiai proporcingas taikinio kiekiui, iš pradžių pasiekiantis maksimalią vertę ir palaipsniui mažėjant, kai taikinys didėja.Pavyzdžiui, naudojant CRISPR-Cas13a nuo taikinio priklausomą trans-skilimo mechanizmą, Tian ir kt.[97] sukūrė naują atpažinimo strategiją, skirtą aptikti RNR, kurios tiesiogiai apeina atvirkštinę transkripciją (6a pav.).Prisijungus prie papildomų tikslinių RNR, CRISPR-Cas13-RNR kompleksas gali būti aktyvuotas, sukeldamas transkolaterinį skilimą nespecifinėmis reporterinėmis RNR.Fluorescenciniu būdu pažymėtą reporterį [fluoroforą (F)] užgesina nepažeistas gesiklis (Q) ir fluorescuoja, kai suskaidomas aktyvuoto komplekso.
Elektrocheminio aptikimo pranašumas yra didelis aptikimo greitis, lengva gamyba, maža kaina, lengva nešiotis ir automatinis valdymas.Tai galingas POCT taikomųjų programų analitinis metodas.Remiantis grafeno lauko tranzistoriais Gao ir kt.[98] sukūrė nanobiojutiklį, skirtą daugkartiniam Laimo ligos antigenų iš Borrelia burgdorferi bakterijų aptikimui, kurio aptikimo riba yra 2 pg/mL (6b pav.).
Kolorimetriniai tyrimai buvo naudojami POCT programose, nes jie naudojasi perkeliamumo, mažos kainos, lengvo paruošimo ir vaizdinio skaitymo pranašumais.Kolorimetrinis aptikimas gali naudoti peroksidazę arba į peroksidazę panašių nanomedžiagų oksidaciją, nanomedžiagų agregaciją ir indikatorinių dažų pridėjimą, kad informacija apie tikslinių nukleorūgščių buvimą būtų paversta matomais spalvos pokyčiais [99, 100, 101].Pažymėtina, kad aukso nanodalelės yra plačiai naudojamos kuriant kolorimetrines strategijas, o dėl jų gebėjimo sukelti greitus ir reikšmingus spalvų pokyčius, didėja susidomėjimas POCT kolorimetrinių platformų, skirtų infekcinių ligų diagnostikai in situ, kūrimu [102].Integruotu išcentriniu mikrofluidiniu prietaisu [103] užteršto pieno mėginiuose esantys maisto patogenai gali būti automatiškai aptikti 10 bakterijų ląstelių lygyje, o rezultatai gali būti vizualiai nuskaitomi per 65 minutes (6c pav.).
Magnetinio jutimo metodai gali tiksliai aptikti analites naudojant magnetines medžiagas, todėl pastaraisiais dešimtmečiais buvo didelis susidomėjimas POCT taikymu.Magnetinio jutimo metodai turi keletą unikalių pranašumų, pavyzdžiui, pigių magnetinių medžiagų, o ne brangių optinių komponentų.Tačiau magnetinio lauko naudojimas pagerina aptikimo efektyvumą ir sumažina mėginio paruošimo laiką [104].Be to, magnetinio zondavimo rezultatai rodo didelį specifiškumą, jautrumą ir didelį signalo ir triukšmo santykį dėl nereikšmingo biologinių mėginių magnetinio fono signalo [105].Sharma ir kt.integravo magnetinio tunelio sankryžos biojutiklį į nešiojamą mikroschemos platformą.[106] daugkartiniam patogenų aptikimui (6d pav.).Biosensoriai jautriai aptinka subnanomolines nukleino rūgštis, išskirtas iš patogenų.
Tipiškas signalo aptikimo metodas.Hiperlokalizuoto Cas13a aptikimo koncepcija (pritaikyta iš [97]).b Grafeno nanobiosensorius FET kartu su Lyme GroES scFv (pritaikytas iš [98]).c Kolorimetrinės indikacijos, skirtos daugkartiniam maistu plintančių patogenų aptikimui išcentrinėje mikrofluidinėje mikroschemoje: Nr. 1 ir Nr. 3 mėginiai su tiksliniais patogenais ir Nr. 2, Nr. 4 ir Nr. 5 mėginiai be tikslinių patogenų (pritaikyta iš [103]) .d Biosensorius, pagrįstas magnetinio tunelio jungtimi, įskaitant platformą, įmontuotą blokavimo stiprintuvą, valdymo bloką ir maitinimo šaltinį signalams generuoti/gauti (pritaikytas iš [106]).GFET Grafenas FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS dimetikonas, PMMA polimetilmetakrilatas
Nepaisant puikių minėtų aptikimo metodų savybių, jie vis tiek turi trūkumų.Šie metodai yra lyginami (1 lentelė), įskaitant kai kurias programas su išsamia informacija (už ir prieš).
Tobulėjant mikrofluidikai, mikroelektromechaninėms sistemoms, nanotechnologijoms ir medžiagų mokslui, mikroskysčių lustų naudojimas infekcinėms ligoms aptikti nuolat tobulėja [55,96,107,108].Tikslus manipuliavimas miniatiūrine įranga ir skysčiais prisideda prie diagnostikos tikslumo ir ekonomiškumo.Todėl tolesnei plėtrai buvo dedamos pastangos optimizuoti ir atnaujinti lustus, todėl gaunami įvairūs mikrofluidiniai lustai su skirtingomis struktūromis ir funkcijomis.Čia trumpai pristatome kelis dažniausiai pasitaikančius mikrofluidinių platformų tipus ir palyginame jų charakteristikas (privalumus ir trūkumus).Be to, daugumoje toliau išvardytų pavyzdžių daugiausia dėmesio skiriama kovai su SARS-CoV-2.
LOCC yra labiausiai paplitusios miniatiūrinės sudėtingos analitinės sistemos, o jų operacijos yra labai miniatiūrinės, integruotos, automatizuotos ir lygiagrečios nuo mėginio įpurškimo ir paruošimo, srauto valdymo ir skysčių aptikimo [109, 110].Skysčiais manipuliuojama naudojant kruopščiai sukurtą geometriją ir daugelio fizinių efektų, tokių kaip slėgio gradientai, kapiliarinis veikimas, elektrodinamika, magnetiniai laukai ir akustinės bangos, sąveiką [111].LOCC rodo puikius didelio našumo atrankos ir daugkartinio aptikimo pranašumus, nes yra greitas analizės greitis, mažas imties dydis, mažas energijos suvartojimas ir didelis valdymo bei veikimo efektyvumas;tačiau LOCC įrenginiai yra labai subtilūs, jų gamyba, pakavimas ir sąsaja.Tačiau multipleksavimas ir pakartotinis naudojimas susiduria su didžiuliais sunkumais [96].Palyginti su kitomis platformomis, LOCC turi unikalių pranašumų, susijusių su maksimalia taikymo įvairove ir geriausiu technologijų suderinamumu, tačiau akivaizdūs ir jo trūkumai, būtent didelis sudėtingumas ir prastas pakartojamumas.Priklausomybė nuo išorinių siurblių, kurie dažnai yra dideli ir brangūs, dar labiau riboja jų naudojimą POCT.
COVID-19 protrūkio metu LOCC sulaukė daug dėmesio.Tuo pačiu metu yra keletas naujų lustų, kuriuose derinamos kelios technologijos.Pavyzdžiui, išmanieji telefonai dabar plačiai naudojami kaip nešiojamieji analizės įrenginiai ir turi didelį LOCC integravimo potencialą.Sun ir kt.[21] pagamino mikroskysčių lustą, leidžiantį multipleksuoti specifines penkių patogenų, įskaitant SARS-CoV-2, nukleorūgščių sekas, naudojant LAMP, ir išanalizavo jas išmaniuoju telefonu per 1 valandą po reakcijos pabaigos.Kitas pavyzdys, Sundah ir kt.[112] sukūrė molekulinį jungiklį [katalizinį stiprinimą molekulinio pereinamojo būsenos jungikliu (CATCH)], skirtą tiesiogiai ir jautriai aptikti SARS-CoV-2 RNR taikinius naudojant išmaniuosius telefonus. CATCH yra suderinamas su nešiojamuoju LOCC ir užtikrina puikų našumą (maždaug 8 RNR kopijos/μl; < 1 h kambario temperatūroje) [112]. CATCH yra suderinamas su nešiojamuoju LOCC ir užtikrina puikų našumą (maždaug 8 RNR kopijos/μl; < 1 h kambario temperatūroje) [112]. CATCH совместим с портативным LOCC и обеспечивает превосходную производительность (примерно 8 копратна 1 портативным; CATCH yra suderinamas su nešiojamuoju LOCC ir užtikrina puikų pralaidumą (maždaug 8 RNR kopijos/µl; < 1 h kambario temperatūroje) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时]） CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时]） CATCH совместим с портативными LOCC ir обладает превосходной производительностью (примерно 8 копий РНК/мкри; трай 1.2.1. CATCH yra suderinamas su nešiojamaisiais LOCC ir pasižymi puikiu našumu (maždaug 8 RNR kopijos/µl; < 1 valanda kambario temperatūroje) [112].Be to, LOCC įrenginiai, skirti molekulinei diagnostikai, taip pat naudoja tam tikras varomąsias jėgas, tokias kaip vakuumas, tempimas ir elektriniai laukai.Kang ir kt.[113] pademonstravo realaus laiko itin greitą nanoplazmos ant lusto PGR, skirtą greitai ir kiekybiškai diagnozuoti COVID-19 lauke, naudojant vakuuminį plazmoninį skystą PGR lustą.Li ir kt.[114] vėliau sukūrė tempimo varomą mikrofluidinį lustą, kuris leido diagnozuoti COVID-19.Platforma naudoja RT-LAMP stiprinimo sistemą, kad nustatytų, ar mėginys yra kokybiškai teigiamas ar neigiamas.Vėliau Ramachandranas ir kt.[115] pasiekė tinkamus elektrinio lauko gradientus, naudodamas izotachoforezę (ITP), selektyvų jonų fokusavimo metodą, įdiegtą mikrofluidikoje.Naudojant ITP, tikslinė RNR iš neapdorotų nosiaryklės tamponų mėginių gali būti automatiškai išgryninta.Tada Ramachandranas ir kt.[115] Sujungus šį ITP išgryninimą su ITP sustiprintu LAMP ir CRISPR tyrimais, SARS-CoV-2 žmogaus nosiaryklės tamponuose ir klinikiniuose mėginiuose aptiktas maždaug per 35 minutes.Be to, nuolat kyla naujų idėjų.Jadhav ir kt.[116] pasiūlė diagnostinę schemą, pagrįstą paviršiumi patobulinta Ramano spektroskopija kartu su mikrofluidiniu prietaisu, kuriame yra arba vertikaliai orientuoti auksu/sidabru padengti anglies nanovamzdeliai, arba vienkartiniai elektrosukami mikro/nanovamzdeliai.Membrana funkcionalizuoti įmontuoti filtrų mikrokanalai yra vienkartiniai.Prietaisas adsorbuoja virusus iš įvairių kūno skysčių/eksudacijų, tokių kaip seilės, nosiaryklės ir ašaros.Taigi viruso titras yra gausus ir virusą galima tiksliai identifikuoti pagal Ramano parašą.
LOAD yra išcentrinė mikrofluidinė platforma, kurioje visi procesai yra valdomi dažnio protokolu, kuris suka mikrostruktūrinį substratą [110].LOAD įtaisui būdinga tai, kad išcentrinė jėga naudojama kaip svarbi varomoji jėga.Skysčius taip pat veikia kapiliarinės, Eulerio ir Koriolio jėgos.Naudojant centrifuginį įrenginį, analizės atliekamos nepertraukiamu skysčio režimu nuo radialinės į vidų iki išorinės padėties, todėl nereikia papildomų išorinių vamzdelių, siurblių, pavarų ir aktyvių vožtuvų.Trumpai tariant, vienas valdymo metodas supaprastina veikimą.Jėgos, veikiančios skystį tame pačiame mikrofluidiniame kanale, esančiame tuo pačiu atstumu nuo apkrovos centro, yra lygios, todėl galima pakartoti kanalo struktūrą.Taigi, LOAD įranga yra paprastesnė ir ekonomiškesnė projektuojant ir gaminant nei įprastą LOCC įrangą, o reakcijos iš esmės yra nepriklausomos ir lygiagrečios;tačiau dėl didelio išcentrinės įrangos mechaninio stiprumo prieinama drožlių medžiaga yra ribota, o nedideli kiekiai yra sudėtingi.prie automobilio.Tuo pačiu metu dauguma LOAD įrenginių yra skirti tik vienkartiniam naudojimui, o tai yra brangu didelio masto aptikimui [96, 117, 118, 119].
Pastaraisiais dešimtmečiais LOAD, laikomas vienu perspektyviausių mikrofluidinių prietaisų, sulaukė nemažo mokslininkų ir gamintojų dėmesio.Taigi LOAD sulaukė plataus pripažinimo ir buvo naudojamas infekcinių patogenų molekulinei diagnostikai [120, 121, 122, 123, 124], ypač COVID-19 protrūkio metu.Pavyzdžiui, 2020 m. pabaigoje Ji ir kt.[60] parodė tiesioginį RT-qPCR tyrimą, skirtą greitam ir automatiniam lygiagrečiam SARS-CoV-2 ir A ir B gripo infekcijų aptikimui gerklės tepinėlių mėginiuose.Tada Xiong ir kt.[74] pristatė į LAMP integruotą diskoidinę mikrofluidinę platformą, leidžiančią greitai, tiksliai ir vienu metu aptikti septynis žmogaus kvėpavimo takų koronavirusus, įskaitant SARS-CoV-2, per 40 minučių.2021 m. pradžioje de Oliveira ir kt.[73] pademonstravo polistireno dažų išcentrinę mikrofluidinę lustą, rankiniu būdu valdomą piršto galiuko suktuvu, skirtą RT-LAMP molekulinei COVID-19 diagnostikai.Vėliau Dignan ir kt.[39] pristatė automatizuotą nešiojamąjį centrifuginį mikroįrenginį, skirtą SARS-CoV-2 RNR gryninimui tiesiai iš žando tamponų sekcijų.Medved ir kt.[53] pasiūlė integruotą SARS-CoV-2 aerozolių mėginių ėmimo sistemą su mažo tūrio besisukančia mikrofluidine fluorescencine mikroschema, kurios aptikimo riba yra 10 kopijų/μL ir minimali ciklo riba – 15 minučių.Suarez ir kt.[75] neseniai pranešė apie integruotos modulinės išcentrinės mikrofluidinės platformos, skirtos tiesiogiai aptikti SARS-CoV-2 RNR termiškai inaktyvuotuose nosiaryklės tepinėlių mėginiuose, naudojant LAMP, sukūrimą.Šie pavyzdžiai parodo didelę LOAD naudą ir pažadą COVID-19 molekulinėje diagnostikoje.
1945 m. Muller ir Clegg [125] pirmą kartą pristatė mikrofluidinius kanalus ant popieriaus, naudodami filtravimo popierių ir parafiną.2007 m. Whitesides grupė [126] sukūrė pirmąją funkcinę popieriaus platformą baltymų ir gliukozės tyrimams.Popierius tapo idealiu substratu mikrofluidikai.Popierius turi būdingų savybių, tokių kaip hidrofiliškumas ir porėta struktūra, puikus biologinis suderinamumas, lengvas svoris, lankstumas, sulankstymas, maža kaina, naudojimo paprastumas ir patogumas.Klasikinius µPAD sudaro hidrofilinės / hidrofobinės struktūros, pastatytos ant popieriaus pagrindo.Priklausomai nuo trimatės struktūros, μPAD gali būti skirstomi į dvimačius (2D) ir trimačius (3D) μPAD.2D µPAD gaminami formuojant hidrofobines ribas, kad susidarytų mikrofluidiniai kanalai, o 3D µPAD paprastai gaminami iš 2D mikroskysčio popieriaus sluoksnių šūsnių, kartais naudojant popieriaus lankstymą, slydimo metodus, atvirus kanalus ir 3D spausdinimą [96].Vandeniniai arba biologiniai skysčiai ant μPAD pirmiausia valdomi kapiliarine jėga be išorinio maitinimo šaltinio, palengvinant išankstinį reagentų saugojimą, mėginių tvarkymą ir multipleksinį aptikimą.Tačiau tiksliam srauto valdymui ir multipleksiniam aptikimui trukdo nepakankamas aptikimo greitis, jautrumas ir pakartotinis naudojimas [96, 127, 128, 129, 130].
Kaip neįprasta mikrofluidinė platforma, μPAD buvo plačiai reklamuojamas ir sukurtas infekcinių ligų, tokių kaip HCV, ŽIV ir SARS-CoV-2, molekulinei diagnostikai [131, 132].Selektyviai ir jautriai aptikti HCV, Tengam ir kt.[133] sukūrė naują biojutiklį, pagrįstą fluorescenciniu popieriumi, naudodamas labai specifinį nukleorūgščių zondą, pagrįstą pirolidinilo peptidu.Nukleino rūgštys kovalentiškai imobilizuojamos ant iš dalies oksiduoto celiuliozės popieriaus redukciniu alkilinimo būdu tarp amino grupių ir aldehido grupių, o aptikimas pagrįstas fluorescencija.Šiuos signalus gali nuskaityti specialiai sukurta programėlė su nešiojama fluorescencine kamera kartu su mobiliojo telefono kamera.Vėliau Lu ir kt.[134] sukūrė popieriaus pagrindo lankstų elektrodą, kurio pagrindą sudaro nikelio/aukso nanodalelės/anglies nanovamzdeliai/polivinilo alkoholio organometalinės karkaso kompozicijos, skirtos ŽIV taikinio aptikimui DNR hibridizacijos būdu naudojant metileno mėlyną kaip DNR redokso indikatorių.Visai neseniai Chowdury ir kt.[135] pristatė hipotetinės platformos konstrukciją, skirtą µPAD tyrimams, naudojant neapdorotas paciento seiles kartu su LAMP ir nešiojama vaizdo gavimo technologija, skirta COVID-19 analitės aptikimui.
Šoninio srauto bandymai nukreipia skysčius kapiliarinėmis jėgomis ir kontroliuoja skysčio judėjimą pagal akyto arba mikrostruktūrinio pagrindo drėgnumą ir savybes.Šoninio srauto įtaisus sudaro mėginys, konjugatas, inkubatorius ir aptikimas bei sugeriantys pagalvėlės.LFA esančios nukleino rūgšties molekulės atpažįsta specifinius rišiklius, kurie yra iš anksto saugomi surišimo vietoje ir jungiasi kaip kompleksai.Kai skystis praeina per inkubavimo ir aptikimo plokštes, kompleksus sugauna fiksuojančios molekulės, esančios bandymo ir kontrolės linijose, o tai rodo rezultatus, kuriuos galima nuskaityti tiesiai plika akimi.Paprastai LFA galima atlikti per 2–15 minučių, o tai yra greičiau nei tradicinis atradimas.Dėl specialaus mechanizmo LFA reikalauja nedaug operacijų ir nereikalauja papildomos įrangos, todėl labai patogu naudoti.Jį lengva gaminti ir miniatiūrizuoti, o popierinio pagrindo kaina yra mažesnė.Tačiau jis naudojamas tik kokybinei analizei, o kiekybinis aptikimas yra labai sunkus, o tankinimo galimybė ir pralaidumas yra labai riboti, todėl vienu metu galima aptikti tik vieną pakankamą nukleorūgštį [96 110 127].
Nors dauguma LFA pritaikymų yra orientuoti į imunologinius tyrimus, LFA naudojimas molekulinei diagnostikai mikrofluidiniuose lustuose taip pat yra veiksmingas ir populiarus [136].Hepatito B viruso atveju ŽIV ir SARS-CoV-2 LFA Gong ir kt.[137] pasiūlė nanodalelių LFA platformą ir pademonstravo šios miniatiūrinės ir nešiojamos platformos universalumą jautriai ir kiekybiškai aptikdamas kelis taikinius, tokius kaip HBV nukleorūgštis.Be to, Fu ir kt.[138] pademonstravo naują LFA, pagrįstą patobulinta Ramano spektroskopija, skirtą kiekybinei ŽIV-1 DNR analizei esant mažoms koncentracijoms.Norėdami greitai ir jautriai aptikti SARS-CoV-2, Liu ir kt.[85] sukūrė mikrofluidiniu būdu integruotą RPA šoninio srauto analizę, sujungdamas RT-RPA ir universalią šoninio srauto aptikimo sistemą į vieną mikrofluidinę sistemą.
Įvairių mikrofluidinių platformų pritaikymas skiriasi priklausomai nuo konkrečių tyrimų, visapusiškai išnaudojant platformų galimybes ir privalumus.LOCC su įperkamais vožtuvais, siurbliais ir ortakiais yra pati visapusiškiausia pritaikymo įvairovės ir sąveikos platforma, turinti didžiausią plėtros erdvę.Todėl tikimės ir rekomenduojame iš pradžių LOCC atlikti naujausius tyrimus ir optimizuoti sąlygas.Be to, tikimasi, kad sistemoje bus atrasti ir naudojami efektyvesni ir tikslesni metodai.LOAD puikiai valdo skysčius iš esamų LOCC įrenginių ir demonstruoja unikalius privalumus atskirose pavarose naudojant išcentrinę jėgą be išorinių pavarų, o lygiagretus atsakas gali būti atskirtas ir sinchronizuojamas.Taigi ateityje LOAD taps pagrindine mikroskysčių platforma, kurioje bus mažiau rankinių operacijų ir brandesnės bei automatizuotos technologijos.µPAD platforma sujungia LOCC ir popierinių medžiagų pranašumus, kad būtų galima atlikti nebrangią vienkartinę diagnostiką.Todėl ateityje plėtojant reikėtų orientuotis į patogias ir nusistovėjusias technologijas.Be to, LFA puikiai tinka aptikti plika akimi, todėl žada sumažinti mėginių suvartojimą ir pagreitinti aptikimą.Išsamus platformų palyginimas parodytas 2 lentelėje.
Skaitmeninės analizės padalija mėginį į daugybę mikroreaktorių, kurių kiekviename yra atskiras skaičius tikslinių molekulių [139, 140].Skaitmeniniai tyrimai suteikia didelių pranašumų atliekant absoliutų kiekybinį nustatymą, atliekant tūkstančius lygiagrečių biocheminių eksperimentų vienu metu ir atskirai mikronų skalės skyriuose, o ne nuolatinėje fazėje.Palyginti su tradicine mikrofluidika, kamerinės reakcijos gali sumažinti mėginio tūrį, padidinti reakcijos efektyvumą ir būti lengvai integruotos su kitais analizės metodais, nereikalaujant kanalų, siurblių, vožtuvų ir kompaktiškų konstrukcijų [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .Norint pasiekti vienodą ir tikslų tirpalų, įskaitant reagentus ir mėginius, pvz., ląsteles, nukleorūgštis ir kitas daleles ar molekules, atskyrimą skaitmeniniuose tyrimuose naudojami du metodai: (1) lašelinės emulsijos, kuriose naudojamas skysčio sąsajos nestabilumas;(2) masyvo padalijimas atliekamas pagal įrenginio geometrinius apribojimus.Pirmuoju metodu lašeliai, kuriuose yra reagentų ir mėginių mikrokanaluose, gali būti sukurti pasyviais metodais, tokiais kaip bendra srovė, kryžminis srautas, srauto fokusavimas, etapinis emulsinimas, mikrokanalų emulsinimas ir membranos naudojant klampias šlyties jėgas ir emulsiją keičiant kanalą.lokalizacija [143, 145, 146, 148, 149] arba naudojant aktyvius metodus [150, 151], kurie per elektrinį, magnetinį, terminį ir mechaninį valdymą įveda papildomos energijos.Taikant pastarąjį metodą, geriausias skysčio tūrio vienodumas mikroskysčių kamerose pasiekiamas išlaikant tokio paties dydžio erdvines struktūras, tokias kaip mikroduobės ir paviršiaus matricos [152,153,154].Pažymėtina, kad lašeliai yra pagrindinės srauto sekcijos, kurias taip pat galima generuoti ir manipuliuoti elektrodų matricose, pagrįstose skaitmenine mikrofluidika (DMF).Dielektrikų elektrodrėkinimas yra viena iš geriausiai ištirtų DMF teorijų, nes elektrodrėkinimas leidžia tiksliai manipuliuoti atskirais lašais, kontroliuoti skysčio formą ir asimetrinius elektros signalus, einančius per skirtingas puses [141, 144].Pagrindinės operacijos su lašeliais DMF apima rūšiavimą, skaidymą ir sujungimą [151, 155, 156], kurios gali būti taikomos įvairiose analizės srityse, ypač molekuliniame aptikime [157, 158, 159].
Skaitmeninis nukleino rūgščių aptikimas yra trečios kartos molekulinės diagnostikos technologija, kuri atliekama naudojant įprastinę PGR ir kiekybinę realaus laiko PGR (qPCR), lygiagrečiai su didelio našumo sekos nustatymu ir skysčio biopsija.Per pastaruosius du dešimtmečius skaitmeninės nukleorūgštys sparčiai vystėsi infekcinių patogenų molekulinės diagnostikos srityje [160, 161, 162].Absoliutus skaitmeninių nukleorūgščių aptikimo kiekybinis įvertinimas prasideda mėginių ir reagentų pakavimu į atskirus skyrius, siekiant užtikrinti, kad kiekviena tikslinė seka turėtų vienodą tikimybę patekti į kiekvieną atskirą skyrių.Teoriškai kiekvienai sekcijai gali būti priskirtos kelios tikslinės sekos arba gali nebūti nepriklausomos mikroreakcijos sistemos.Taikant įvairius aukščiau aprašytus jutimo mechanizmus, skyrius su mikrobų taikinių sekomis, kurios generuoja signalus, viršijančius tam tikrą slenkstį, gali būti vizualizuojamos plika akimi arba mašina ir pažymimos kaip teigiamos, o kiti skyriai, generuojantys signalus žemiau slenksčio, yra pažymėti kaip teigiami. .neigiamų, dėl kurių kiekvienos sekcijos signalas yra loginis.Taigi, apskaičiuojant sukurtų skyrių skaičių ir teigiamų rezultatų greitį po reakcijos, originalias tiriamųjų mėginių kopijas galima suderinti naudojant Puasono pasiskirstymo formulę, nereikalaujant standartinės kreivės, kuri reikalinga atliekant įprastines kiekybines analizes, pvz. kaip qPCR.[163] Palyginti su tradiciniais molekulinės diagnostikos metodais, skaitmeninis nukleorūgščių aptikimas turi didesnį automatizavimo laipsnį, didesnį analizės greitį ir jautrumą, mažiau reagentų, mažiau užterštumo ir paprastesnį projektavimą bei gamybą.Dėl šių priežasčių per kritinį SARS-CoV-2 protrūkį buvo gerai ištirtas skaitmeninių tyrimų, ypač lašais pagrįstų metodų, naudojimas molekulinei diagnostikai, derinant stiprinimo ir signalo nuskaitymo metodus.Pavyzdžiui, Yin ir kt.[164] derino skaitmeninius lašelių ir greitojo PGR metodus, kad aptiktų ORF1ab, N ir RNase P genus SARS-CoV-2 mikrofluidiniame luste.Pažymėtina, kad sistema sugebėjo nustatyti teigiamą signalą per 115 sekundžių, o tai yra greičiau nei įprastas PGR, o tai rodo jos veiksmingumą aptinkant priežiūros vietą (7a pav.).Dong ir kt.[165], Sow ir kt.[157], Chen ir kt.[166] ir Alteri ir kt.[167] taip pat pritaikė skaitmeninį lašelių PGR (ddPCR), kad aptiktų SARS-CoV-2 mikrofluidinėje sistemoje ir gautų įspūdingų rezultatų.Norėdami dar labiau pagerinti aptikimo greitį, Shen ir kt.[168] ddPCR pagrįstą lustinį vaizdą pasiekė vos per 15 s, nenaudojant vaizdų susiuvimo metodų, pagreitindamas ddPCR technologijos procesą nuo laboratorijos iki taikymo.Taikomi ne tik terminės amplifikacijos metodai, tokie kaip PGR, bet ir izoterminės amplifikacijos metodai, siekiant supaprastinti reakcijos sąlygas ir greitą atsaką.Lu ir kt.[71] sukūrė „SlipChip“ lašelių analizei, galinčią vienu žingsniu generuoti įvairaus dydžio didelio tankio lašelius ir kiekybiškai įvertinti SARS-CoV-2 nukleorūgštis naudojant skaitmeninę LAMP (7b pav.).Kaip sparčiai besivystanti technologija, CRISPR taip pat gali atlikti svarbų vaidmenį skaitmeniniame nukleino rūgščių aptikime, naudojant patogų kolorimetrinį vaizdą, nereikalaujant papildomų nukleino rūgščių dėmių.Ackerman ir kt.sukūrė kombinatorinę matricos reakciją multipleksiniam nukleorūgščių įvertinimui.[158] mikrošulinėlių tyrime aptiko 169 su žmonėmis susijusius virusus, įskaitant SARS-CoV-2, lašeliuose, kuriuose yra CRISPR-Cas13 pagrindu veikiančių nukleorūgščių aptikimo reagentų (7c pav.).Be to, toje pačioje sistemoje galima naudoti izoterminį stiprinimą ir CRISPR technologiją, kad būtų derinami abiejų privalumai.Park ir kt.[169] CRISPR/Cas12a skaitmeninis tyrimas buvo sukurtas komercinėje mikrofluidinėje mikroschemoje, skirta aptikti išskirtą ir karščiu nužudytą SARS-CoV-2, paremtą vienos pakopos RT-RPA su trumpesniu ir didesniu signalo į foną aptikimu. laiko santykis., platesnis dinaminis diapazonas ir geresnis jautrumas (7d pav.).Kai kurie šių pavyzdžių aprašymai pateikti 3 lentelėje.
Tipiška skaitmeninė nukleino rūgščių aptikimo platforma.a Spartią skaitmeninę PGR darbo eigą sudaro keturi pagrindiniai žingsniai: mėginio paruošimas, reakcijos mišinio paskirstymas, amplifikacijos procesas ir tikslo kiekybinis nustatymas (pritaikytas iš [164]).b Schema, rodanti SlipChip lašelių analizę dėl didelio tankio lašelių susidarymo (pritaikyta iš [71]).c CARMEN-Cas darbo eigos diagrama13 (pritaikyta iš [158]).d Pažangaus skaitmeninio virusų aptikimo su CRISPR/Cas viename puode apžvalga (pritaikyta iš [169]).Vanduo aliejuje, polidimetilsiloksano PDMS, PGR polimerazės grandininė reakcija, DAQ duomenų rinkimas, PID proporcingas integralinis darinys, CARMEN kombinatorinė matricos reakcija, skirta multipleksiniam nukleorūgščių įvertinimui, SARS-CoV-2, sunkus ūminis kvėpavimo sindromas, koronavirusas 2, RT Atvirkštinės transkriptazės rekombinazės polimerazės-RPA stiprinimas, S/B signalas fone