žinios

Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com.Naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą.Norėdami gauti geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“).Tuo tarpu norėdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę pateiksime be stilių ir „JavaScript“.
Fermentiniai artumo žymėjimo metodai, pagrįsti aktyvuotais esteriais arba fenoksiradikalais, plačiai naudojami subląsteliniams proteomams ir baltymų sąveikoms gyvose ląstelėse nustatyti.Tačiau aktyvuoti esteriai yra mažiau reaktyvūs, todėl ženklinimo spindulys yra platus, o peroksido apdorojimo metu susidarantys fenoksi radikalai gali trukdyti redokso keliams.Čia mes pranešame apie artumo žymėjimo priklausomą fotoaktyvavimo (PDPL) metodą, sukurtą genetiškai susiejant miniSOG fotosensibilizatoriaus baltymą su dominančiu baltymu.Suveikia mėlyna šviesa ir kontroliuojamas ekspozicijos laikas, generuojamas pavienis deguonis, o po to anilino zondu pasiekiamas erdvėlaikis histidino likučių žymėjimas.Mes demonstruojame jo aukštą tikslumą per organelių specifinį proteomų kartografavimą.PDPL palyginimas su TurboID rodo konkretesnę ir išsamesnę PDPL proteominę aprėptį.Tada mes pritaikėme PDPL su liga susijusiam transkripcijos koaktyvatoriui BRD4 ir E3 Parkin ligazei ir radome anksčiau nežinomus sąveikos veiksnius.Atliekant per didelės ekspresijos atranką, Parkinui buvo nustatyti du nežinomi substratai, Ssu72 ir SNW1, kurių degradaciją skatina ubikvitinacijos-proteasomos kelias.
Tikslus baltymų tinklų apibūdinimas yra daugelio pagrindinių ląstelių procesų pagrindas.Todėl labai tikslus baltymų sąveikos erdvėlaikis žemėlapis suteiks molekulinį pagrindą biologiniams keliams, ligos patologijoms iššifruoti ir sutrikdyti šias sąveikas gydymo tikslais.Šiuo tikslu labai pageidautini metodai, galintys aptikti laikiną sąveiką gyvose ląstelėse arba audiniuose.Afiniteto gryninimo masės spektrometrija (AP-MS) istoriškai buvo naudojama identifikuoti dominančių baltymų (POI) surišimo partnerius.Sukūrus kiekybinės proteomikos metodus, buvo sukurta Bioplex3.0 – didžiausia baltymų tinklų duomenų bazė AP-MS pagrindu.Nors AP-MS yra labai galingas, ląstelių lizės ir skiedimo etapai darbo eigoje yra nukreipti į silpną ir trumpalaikę surišimo sąveiką ir įveda artefaktus po lizės, pvz., klaidingas sąveikos poras, kurioms prieš lizę nėra skirstymo į skyrius.
Siekiant išspręsti šias problemas, buvo sukurtos nenatūralios aminorūgštys (UAA) su kryžminėmis grupėmis ir fermentinės netoliese esančios žymėjimo (PL) platformos (pvz., APEX ir BioID)5.Nors UAA metodas buvo sėkmingai pritaikytas daugelyje scenarijų ir suteikia informacijos apie tiesioginius baltyminius klijus, vis tiek reikia optimizuoti UAA įterpimo vietą.Dar svarbiau, kad tai yra stechiometrinis ženklinimo metodas, kuriam trūksta katalizinio ženklinimo įvykių pakeitimo.Priešingai, fermentiniai PL metodai, tokie kaip BioID metodas, sulieja sukurtą biotino ligazę su POI7, kuris vėliau suaktyvina biotiną, kad susidarytų reaktyvus biotinil-AMP esterio tarpinis produktas.Taigi fermentas katalizuoja ir išskiria aktyvuotą biotino „debesį“, kuris žymi proksimalinius lizino likučius.Tačiau BioID reikia daugiau nei 12 valandų, kad gautų pakankamą pažymėtą signalą, o tai neleidžia jo naudoti su laikinąja skiriamąja geba.Naudojant kryptingą evoliuciją, pagrįstą mielių ekranu, TurboID buvo sukurtas remiantis BioID, kad būtų efektyvesnis, leidžiantis efektyviai ženklinti biotinu per 10 minučių, o tai leidžia ištirti dinamiškesnius procesus.Kadangi TurboID yra labai aktyvus ir endogeninio biotino kiekio pakanka žemo lygio ženklinimui, fono ženklinimas tampa potencialia problema, kai pridedant egzogeninio biotino reikalingas labai sustiprintas ir laiku nustatytas ženklinimas.Be to, aktyvuoti esteriai yra prastai reaktyvūs (t1/2 ~ 5 min.), todėl gali susidaryti didelis žymėjimo spindulys, ypač po to, kai kaimyniniai baltymai yra prisotinti biotinu 5. Pagal kitą metodą, genetinis inžinerijos būdu sukurtos askorbato peroksidazės (ty biotino-peroksidazės) suliejimas. fenolio radikalus ir leidžia žymėti baltymus per vieną minutę9, 10. APEX plačiai naudojamas tarpląsteliniams proteomams, membraninių baltymų kompleksams ir citozoliniams signalinių baltymų kompleksams identifikuoti. ląstelių procesai.
Taigi naujas metodas, galintis sukurti reaktyvesnes pažymėtas spindulio slopinimo rūšis su dideliu erdviniu ir laiko tikslumu, labai nepažeidžiant ląstelių kelių, bus svarbus esamų metodų papildymas. Tarp reaktyviųjų rūšių pavienis deguonis patraukė mūsų dėmesį dėl savo trumpo tarnavimo laiko ir riboto difuzijos spindulio (t1/2 < 0,6 µs ląstelėse)13. Tarp reaktyviųjų rūšių pavienis deguonis patraukė mūsų dėmesį dėl savo trumpo tarnavimo laiko ir riboto difuzijos spindulio (t1/2 < 0,6 µs ląstelėse)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и онграниф, 0 Iš aktyvių formų pavienis deguonis patraukė mūsų dėmesį dėl savo trumpo tarnavimo laiko ir riboto difuzijos spindulio (t1/2 < 0,6 µs ląstelėse)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2揨京傉䈕践s！ 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого 22,0 времени жизнич и огра. Tarp aktyvių formų vienetinis deguonis patraukia mūsų dėmesį dėl savo trumpo tarnavimo laiko ir riboto difuzijos spindulio (t1/2 < 0,6 μs ląstelėse).Buvo pranešta, kad pavienis deguonis atsitiktinai oksiduoja metioniną, tiroziną, histidiną ir triptofaną, todėl jis yra polinis 14, 15, kad būtų galima prijungti prie amino ar tiolio pagrindu pagamintų zondų 16, 17 .Nors vienetinis deguonis buvo naudojamas subląstelinio skyriaus RNR žymėjimui, endogeninių POI artumo žymenų atkūrimo strategijos lieka neištirtos.Čia pristatome platformą, vadinamą nuo fotoaktyvacijos priklausomu artumo žymėjimu (PDPL), kur naudojame mėlyną šviesą, kad apšviestume POI, sujungtus su miniSOG fotosensibilizatoriumi, ir suaktyviname vienetinio deguonies generavimą, kad oksiduotų proksimalinius likučius, o po to atliekame modifikacijas, turinčias aminų, kad oksiduotų cheminius zondus į tarpinės gyvos ląstelės..Išbandėme cheminių zondų grupę, kad padidintume žymės specifiškumą, ir nustatėme modifikavimo vietas naudodami atvirą proteomikos darbo eigą.PDPL palyginimas su TurboID rodo konkretesnę ir išsamesnę PDPL proteominę aprėptį.Šį metodą pritaikėme organelėms specifiniams tarpląstelinio proteomo žymenims ir su vėžiu susijusio epigenetinio reguliavimo baltymo BRD4 ir su Parkinsono liga susijusios E3 ligazės Parkin surišimo partnerių bendram proteomų identifikavimui, kuris patvirtino ir žinomą, ir nežinomą baltymų tinklą. sąveikos..PDPL gebėjimas atpažinti E3 substratus dideliuose baltymų kompleksuose yra situacija, kai reikia atpažinti netiesioginius rišiklius.Du nežinomi parkino substratai, tarpininkaujantys ubikvitinacijos proteasomai, buvo patvirtinti in situ.
Fotodinaminė terapija (PDT)19 ir chromoforinis lazerinis inaktyvavimas (CALI)20, kai šviesos švitinimas fotosensibilizatoriais generuoja pavienį deguonį, gali inaktyvuoti tikslinius baltymus arba sukelti ląstelių mirtį.Kadangi vienkartinis deguonis yra labai reaktyvi medžiaga, kurios teorinis difuzijos atstumas yra apie 70 nm, galima kontroliuoti erdviškai ribotą oksidaciją aplink fotosensibilizatorių.Remdamiesi šia koncepcija, mes nusprendėme naudoti vienetinį deguonį, kad pasiektume glaudų baltymų kompleksų žymėjimą gyvose ląstelėse.Sukūrėme PDPL chemoproteominį metodą, skirtą keturioms funkcijoms atlikti: (1) katalizuoti aktyvaus vienetinio deguonies susidarymą, panašų į PL fermentinį metodą;(2) įjungus šviesą pateikti žymėjimą pagal laiką;(3) pakeitus (4) Venkite naudoti endogeninius kofaktorius (pvz., biotiną), kad sumažintumėte foną, arba nenaudokite labai trikdančių egzogeninių reagentų (tokių kaip peroksidai), kad sumažintumėte ląstelių poveikį aplinkos poveikiui.
Fotosensibilizatorius galima suskirstyti į dvi kategorijas, įskaitant mažos molekulinės masės fluoroforus (pvz., rožių bengaliją, metileno mėlyną)22 ir genetiškai koduotus mažus baltymus (pvz., miniSOG, KillerRed)23.Norėdami pasiekti modulinį dizainą, sukūrėme pirmosios kartos PDPL platformą, pridėdami fotosensibilizatorių (PS) baltymus prie POI24, 25 (1a pav.).Apšvitintas mėlyna šviesa, vienkartinis deguonis oksiduoja proksimalines nukleofilinių aminorūgščių liekanas, todėl susidaro elektrofilinis poliškumas, kuris gali toliau reaguoti su amino zondo nukleofilais 16, 17.Zondas sukurtas su alkinine rankena, kad būtų galima spustelėti chemiją ir nuleisti žemyn, kad būtų galima apibūdinti LC/MS/MS.
MiniSOG tarpininkaujamų baltymų kompleksų ženklinimo schema.Veikiamos mėlynos šviesos ląstelės, ekspresuojančios miniSOG-POI, generuoja vienetinį deguonį, kuris modifikuoja sąveikaujančius baltymus, bet ne neprisirišančius baltymus.Tarpiniai fotooksidacijos produktai sulaikomi amino cheminio zondo relinėmis etiketėmis, kad susidarytų kovalentiniai aduktai.Chemijos zondo alkinilo grupė leidžia spustelėti chemiją, kad būtų galima sodrinti ištraukiant žemyn, o po to LC-MS/MS kiekybiškai.b Aminų zondų 1-4 cheminė struktūra.c Reprezentatyvi mitochondrijų lokalizuotų miniSOG sukeltų proteominių žymenų fluorescencinė gelio analizė naudojant zondus 1-4 ir santykinis kiekybinis nustatymas remiantis gelio densitometrija.Cheminių zondų signalo ir fono santykis buvo įvertintas naudojant neigiamus kontrolinius eksperimentus, išskyrus mėlyną šviesą arba naudojant HEK293T ląsteles be miniSOG ekspresijos.n = 2 biologiškai nepriklausomi mėginiai.Kiekvienas taškas reiškia biologinę kopiją.d Reprezentatyvus PDPL aptikimas ir kiekybinis įvertinimas naudojant optimizuotą 3 zondą, kai yra arba nėra nurodytų PDPL komponentų, pvz., c.n = 3 biologiškai nepriklausomi mėginiai.Kiekvienas taškas reiškia biologinę kopiją.Centrinės linijos ir ūsai rodo vidutinį ir ± standartinį nuokrypį.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Konfokalinis vienetinio deguonies vaizdavimas su toli raudona Si-DMA dėme.Mastelio juosta: 10 µm.Gelio vaizdavimas ir konfokaliniai eksperimentai buvo nepriklausomai pakartoti bent du kartus su panašiais rezultatais.
Pirmiausia išbandėme subrendusių fotosensibilizatorių miniSOG26 ir KillerRed23, stabiliai išreikštų HEK293T, gebėjimą tarpininkauti ženklinant proteomą kaip cheminį zondą propargilamino (papildomas 1a pav.).Gelio fluorescencijos analizė parodė, kad visas proteomas buvo paženklintas naudojant miniSOG ir mėlynos šviesos švitinimą, o naudojant KillerRed nebuvo pastebėta jokio matomo ženklinimo produkto.Norėdami pagerinti signalo ir fono santykį, mes išbandėme cheminių zondų rinkinį, kuriame yra anilino (1 ir 3), propilamino (2) arba benzilamino (4).Pastebėjome, kad pačios HEK293T ląstelės turėjo didesnį foninį signalą, palyginti su mėlynos šviesos nebuvimu, galbūt dėl ​​endogeninio riboflavino fotosensibilizatoriaus, flavino mononukleotido (FMN)27. Anilino pagrindu pagaminti 1 ir 3 cheminiai zondai suteikė geresnį specifiškumą, o HEK293T, stabiliai ekspresuojantis miniSOG mitochondrijose, 3 zondo signalas padidėjo > 8 kartus, o 2 zondas, naudojamas RNR žymėjimo metodu CAP-seq, rodo tik ~ 2,5- kartojamas signalo padidėjimas, greičiausiai dėl skirtingų RNR ir baltymų reaktyvumo pasirinkimų (1b, c pav.). Anilino pagrindu pagaminti 1 ir 3 cheminiai zondai suteikė geresnį specifiškumą, o HEK293T, stabiliai ekspresuojantis miniSOG mitochondrijose, 3 zondo signalas padidėjo > 8 kartus, o 2 zondas, naudojamas RNR žymėjimo metodu CAP-seq, rodo tik ~ 2,5- kartojamas signalo padidėjimas, greičiausiai dėl skirtingų RNR ir baltymų reaktyvumo pasirinkimų (1b, c pav.).Anilino pagrindu pagaminti 1 ir 3 cheminiai zondai parodė geresnį specifiškumą: HEK293T, kuris stabiliai išreiškia miniSOG mitochondrijose, rodo daugiau nei 8 kartų signalo padidėjimą 3 zondui, o 2 zondas, naudojamas CAP-seq RNR žymėjimo metodu, tik rodo ~2,5 karto signalo padidėjimą, tikriausiai dėl skirtingų RNR ir baltymų reaktyvumo pasirinkimų (1b, c pav.).基于苯胺的化学探针1 和3 具有更好的特异性，HEK293T 在线粒体中稳定表达miniSOG，探针3 的信号增加> 8 倍，而用于RNA 标记方法CAP-seq 的探针2 仅显示~ 2,5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， HEK293T 在 中 中 稳定 表达 Minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加 增加> 8 倍 而 于 于 于 RNR 标记 CAP-EQ 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ ~ ~ 2,5 -倍信号增加，可能是由于RNAAnilino pagrindu pagaminti 1 ir 3 cheminiai zondai turėjo geresnį specifiškumą, HEK293T stabiliai išreiškė miniSOG mitochondrijose, o 3 zondas turėjo daugiau nei 8 kartus didesnį signalą, o 2 zondas, skirtas CAP-seq RNR žymėjimo metodui, parodė tik ~ 2,5 karto padidėjimą.signale, tikriausiai dėl skirtingų RNR ir baltymo reakcijos pasirinkimų (1b, c pav.).Be to, buvo išbandyti 3 zondo izomerai ir hidrazino zondai (5, 6, 7 zondai), patvirtinantys 3 zondo optimizavimą (papildomas 1b, c pav.).Panašiai, gelio fluorescencinė analizė atskleidė kitus optimizuotus eksperimentinius parametrus: švitinimo bangos ilgį (460 nm), cheminio zondo koncentraciją (1 mM) ir švitinimo laiką (20 min.) (papildomi 2a–c pav.).Praleidus bet kurį PDPL protokolo komponentą ar žingsnį, signalas buvo pakeistas į foną (1d pav.).Pažymėtina, kad baltymų ženklinimas buvo žymiai sumažintas esant natrio azidui arba troloksui, kurie, kaip žinoma, gesina singletinį deguonį.D2O, kuris, kaip žinoma, stabilizuoja vienkartinį deguonį, sustiprina ženklinimo signalą.Siekiant ištirti kitų reaktyviųjų deguonies rūšių indėlį į ženklinimą, manitolio ir vitamino C buvo pridėta, kad būtų sukurti atitinkamai hidroksilo ir superoksido radikalų šalintojai 18, 29, tačiau nenustatyta, kad jie sumažintų ženklinimą.H2O2 pridėjimas, bet ne apšvietimas, nepaženklino (papildomas 3a pav.).Fluorescencinis vienetinio deguonies vaizdavimas su Si-DMA zondais patvirtino, kad HEK293T-miniSOG laidoje yra viengubo deguonies, bet ne originaliame HEK293T laide.Be to, mitoSOX Red negalėjo aptikti superoksido gamybos po apšvietimo (1e pav. ir papildomas 3b pav.) 30. Šie duomenys tvirtai rodo, kad vienkartinis deguonis yra pagrindinė reaktyvioji deguonies rūšis, atsakinga už vėlesnį proteominį ženklinimą.Buvo įvertintas PDPL citotoksiškumas, įskaitant švitinimą mėlyna šviesa ir cheminius zondus, ir reikšmingo citotoksiškumo nepastebėta (papildomas 4a pav.).
Norint ištirti ženklinimo mechanizmą ir įgalinti baltymų kompleksų proteominį identifikavimą naudojant LC-MS / MS, pirmiausia turime nustatyti, kurios aminorūgštys yra modifikuotos, ir zondo etikečių delta masę.Buvo pranešta, kad metioniną, histidiną, triptofaną ir tiroziną modifikuoja singletinis deguonis14, 15.TOP-ABPP31 darbo eigą integruojame su nešališka atvira paieška, kurią teikia FragPipe skaičiavimo platforma, pagrįsta MSFragger32.Po pavienio deguonies modifikavimo ir cheminio zondo ženklinimo, paspaudimų chemija buvo atlikta naudojant biotino redukcijos etiketę, kurioje yra skaldomas jungiklis, po to neutravidino tempimas ir tripsino virškinimas.Modifikuotas peptidas, vis dar prijungtas prie dervos, buvo fotoskaidomas LC-MS / MS analizei (2a pav. ir 1 papildomi duomenys).Proteome įvyko daug modifikacijų, išvardytų daugiau nei 50 peptidų žemėlapio (PSM) atitikmenų (2b pav.).Keista, bet mes stebėjome tik histidino modifikaciją, tikriausiai dėl didesnio oksiduoto histidino reaktyvumo anilino zondų atžvilgiu nei kitų aminorūgščių.Pagal paskelbtą histidino oksidacijos singletiniu deguonimi mechanizmą21,33 siūloma +229 Da delta masės struktūra atitinka 3 zondo aduktą su 2-oksohistidinu po dviejų oksidacijų, o +247 Da yra hidrolizės produktas. +229 Da (papildomas 5 pav.).MS2 spektro įvertinimas parodė didelį daugumos y ir b jonų identifikavimo patikimumą, įskaitant modifikuotų fragmentų jonų (y ir b) identifikavimą (2c pav.).PDPL modifikuotų histidinų vietinės sekos kontekstinė analizė atskleidė vidutinį motyvų pasirinkimą mažoms hidrofobinėms liekanoms ±1 padėtyse (papildomas 4b pav.).Vidutiniškai kiekvienam baltymui buvo nustatyta 1,4 histidinų, o šių žymenų vietos buvo nustatytos atliekant tirpiklio pasiekiamo paviršiaus ploto (SASA) ir santykinio tirpiklio prieinamumo (RSA) analizę (papildomas 4c, d pav.).
Nešališka darbo eiga, skirta likutiniam selektyvumui tirti naudojant FragPipe skaičiavimo platformą, kurią maitina MSFragger.Skaldomi jungikliai yra naudojami Click chemijoje, kad būtų galima fotoskaidyti modifikuotus peptidus iš streptavidino dervos.Buvo pradėta atvira paieška siekiant nustatyti daugybę modifikacijų ir atitinkamų likučių.b Priskirkite modifikacijų, vykstančių visame proteome, masę.Peptidų kartografavimas PSM.c 3 zondu modifikuotų histidino vietų MS2 spektrinė anotacija. Kaip reprezentatyvus pavyzdys, kovalentinė reakcija su zondu 3 pridėjo +229,0938 Da prie modifikuotos aminorūgšties.d Mutacijų tyrimas, naudojamas PDPL žymenims patikrinti.PRDX3 (H155A, H225A) ir PRDX1 (H10A, H81A, H169A) buvo transfekuoti laukinio tipo plazmidėmis, kad būtų galima nustatyti anti-Flag.e Sintetinis peptidas buvo sureaguotas su išgrynintu miniSOG, dalyvaujant 3 zondui, o atitinkami produktai su Δm +247 ir +229 buvo pažymėti LC-MS spektre.f In vitro baltymų ir baltymų sąveika, modeliuojama naudojant miniSOG-6xHis-tag ir anti-6xHis antikūnus.Antibiotino (streptavidino-HRP) ir miniSOG-6xHis/anti-6xHis antikūnų kompleksų, pažymėtų 3 zondu, anti-pelės Western blot analizė, atsižvelgiant į šviesos poveikio laiką.Atskirų baltymų etiketės išreiškiamos atitinkama molekuline mase: LC antikūno lengvoji grandinė, HC antikūno sunkioji grandinė.Šie eksperimentai buvo nepriklausomai pakartoti mažiausiai du kartus su panašiais rezultatais.
Ženklinimo vietos biocheminiam patikrinimui, masės spektrometrijos būdu nustatyti PRDX3 ir PRDX1 buvo pakeisti iš histidino į alaniną ir transfekcijos tyrimuose lyginami su laukiniu tipu.PDPL rezultatai parodė, kad mutacija žymiai sumažino žymėjimą (2d pav.).Tuo tarpu atviroje paieškoje nustatytos peptidų sekos buvo susintetintos ir reagavo in vitro su išgrynintu miniSOG, esant 3 zondui ir mėlynai šviesai, todėl gaunami produktai, kurių masės poslinkis yra +247 ir +229 Da, kai aptinkama LC-MS (1 pav. 2e).).Norėdami patikrinti, ar sąveikaujantys proksimaliniai baltymai gali būti pažymėti in vitro, reaguojant į miniSOG fotoaktyvaciją, sukūrėme dirbtinį artumo tyrimą, sąveikaudami tarp miniSOG-6xHis baltymo ir anti-His monokloninio antikūno in vitro (2f pav.).Šiame tyrime tikėjomės proksimalaus antikūnų sunkiųjų ir lengvųjų grandinių žymėjimo miniSOG.Tiesą sakant, anti-pelės (atpažįstant sunkias ir lengvas anti-6xHis žymėto antikūno grandines) ir streptavidino Western blots parodė stiprų sunkiųjų ir lengvųjų grandinių biotinilinimą.Pažymėtina, kad pastebėjome miniSOG autobiotinilinimą dėl 6xHis žymos ir kryžminių ryšių tarp lengvųjų ir sunkiųjų grandinių, kurie gali būti susiję su anksčiau aprašytu atotrūkiu tarp lizino ir 2-oksohistidino proksimalinio atsako.Apibendrinant darome išvadą, kad PDPL modifikuoja histidiną priklausomai nuo artumo.
Kitas mūsų tikslas buvo apibūdinti tarpląstelinį proteomą, kad patikrintume in situ ženklinimo specifiškumą.Todėl mes stabiliai išreiškėme miniSOG HEK293T ląstelių branduolyje, mitochondrijų matricoje arba išorinėje ER membranoje (3a pav.).Gelio fluorescencijos analizė atskleidė gausias pažymėtas juostas trijose tarpląstelinėse vietose ir skirtingus ženklinimo modelius (3b pav.).Fluorescencinė vaizdo analizė parodė didelį PDPL specifiškumą (3c pav.).Po PDPL darbo eigos sekė paspaudimų reakcijos su rodamino dažais, kad būtų apibūdintos tarpląstelinės proteomos, naudojant fluorescencinę mikroskopiją, o PDPL signalai buvo kolokalizuoti naudojant DAPI, mitochondrijų stebėjimo priemones arba ER stebėjimo priemones, patvirtinančius aukštą PDPL tikslumą.Trijų organelių vietose PDPL palyginimas su TurboID, naudojant avidino Western blot, parodė, kad PDPL buvo pažymėtas tiksliau, palyginti su jų atitinkamomis kontrolėmis.PDPL sąlygomis atsirado daugiau pažymėtų juostų, rodančių daugiau PDPL pažymėtų baltymų (papildomi 6a-d pav.).
Scheminis miniSOG tarpininkaujamo organelių specifinio proteomo ženklinimo vaizdas.miniSOG nukreipia mitochondrijų matricą, susiliedamas su žmogaus COX4 (mito-miniSOG) N-galinėmis 23 aminorūgštimis, branduolį susiliedamas su H2B (branduolys-miniSOG) ir Sec61β per citoplazminę ER membranos pusę (ER-miniSOG). ).Indikacijos apima gelio vaizdavimą, konfokalinį vaizdą ir masės spektrometriją.b Reprezentatyvūs trijų organeliams būdingų PDPL profilių gelio vaizdai.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Reprezentatyvūs konfokaliniai HEK293T ląstelių, stabiliai ekspresuojančių miniSOG, su skirtingomis tarpląstelinėmis lokalizacijomis atvaizdai, aptikti antikūnu, pažymėtu V5 (raudona).Subląsteliniai žymekliai naudojami mitochondrijoms ir ER (žalia).PDPL darbo eiga apima miniSOG (geltona spalva) pažymėtų tarpląstelinių proteomų aptikimą naudojant Cy3-azido paspaudimo chemiją.Mastelio juosta: 10 µm.d PDPL pažymėtų proteomų vulkaninės diagramos įvairiose organelėse, kiekybiškai įvertintos nepažymėtu kiekybiniu įvertinimu (n = 3 nepriklausomi biologiniai eksperimentai).Dviejų uodegų Studento t testas buvo naudojamas ugnikalnių sklypuose.HEK293T laukinis tipas buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė. Ryškiai pakitę baltymai paryškinti raudonai (p < 0,05 ir >2 karto jonų intensyvumo skirtumas). Ryškiai pakitę baltymai paryškinti raudonai (p < 0,05 ir >2 karto jonų intensyvumo skirtumas). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 ir >2-кратная разница в интенсивности ионов). Ryškiai pakitę baltymai paryškinti raudonai (p < 0,05 ir > 2 kartų skirtumas tarp jonų intensyvumo).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Reikšmingai pakitę baltymai paryškinti raudonai (p < 0,05 ir > 2 kartų joninės stiprumo skirtumas).Susiję baltymai, svarbūs HEK293T-miniSOG, bet nėra svarbūs HEK293T, rodomi žaliai.e Eksperimentų proteominių duomenų rinkinių specifiškumo analizė d.Bendras statistiškai reikšmingų baltymų skaičius kiekvienoje organelėje (raudoni ir žali taškai) pažymėtas viršuje.Histogramos rodo baltymus, lokalizuotus organelėse, remiantis MitoCarta 3.0, GO analize ir A. Ting ir kt.žmonių.Atskiri mitochondrijų, branduolių ir ER duomenų rinkiniai.Šie eksperimentai buvo nepriklausomai pakartoti mažiausiai du kartus su panašiais rezultatais.Neapdoroti duomenys pateikiami neapdorotų duomenų failų forma.
Paskatintas gelio ir vaizdo gavimo rezultatų, kiekybinis nustatymas be etiketės buvo naudojamas identifikuotam proteomui nustatyti kiekvienoje organelėje (2 papildomi duomenys).Netransfekuotas HEK293T buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė, norint atimti fono žymenis. Vulkano sklypo analizė parodė žymiai praturtintus baltymus (p < 0,05 ir > 2 kartus jonų intensyvumą), taip pat pavienius baltymus, kurie yra tik miniSOG išreiškiančiose linijose (3d pav. raudoni ir žali taškai). Vulkano sklypo analizė parodė žymiai praturtintus baltymus (p < 0,05 ir > 2 kartus jonų intensyvumą), taip pat pavienius baltymus, kurie yra tik miniSOG išreiškiančiose linijose (3d pav. raudoni ir žali taškai). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Vulkano sklypo analizė parodė reikšmingai praturtėjusius baltymus (p<0,05 ir > 2 kartų jonų intensyvumą), taip pat pavienius baltymus, kurie yra tik miniSOG ekspresuojančiose linijose (3d pav., raudoni ir žali taškai).火山图 分析 显示 显着 富集 富集 的 （（（P <0,05 和> 2 倍 离子 强度 以及 以及 仅 在于 在于 在于 在于 表达 系 中 的 单一 蛋白质 图 3D 红色 和 绿色点））。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。火山图 分析 出 显着 的 蛋白质 （P <0,05 和> 2 倍 离子） 仅 存 在于 在于 在于 在于 在于 系 的 单一 蛋白质 （图 3D 红色 绿色点 。。。）））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Vulkano sklypo analizė atskleidė reikšmingai praturtintus baltymus (p<0,05 ir >2x joninę stiprumą), taip pat pavienius baltymus, esančius tik miniSOG ekspresijos linijoje (raudoni ir žali taškai 3d pav.).Sujungę šiuos duomenis nustatėme atitinkamai 1364, 461 ir 911 statistiškai reikšmingų branduolinių, mitochondrijų ir ER išorinių membranų baltymų.Norėdami analizuoti organelių lokalizuoto PDPL tikslumą, naudojome MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) analizę ir A. Ting et al.duomenų rinkinys8 buvo naudojamas mitochondrijoms, branduoliui ir ER, siekiant patikrinti aptiktų baltymų organelių specifiškumą, atitinkantį 73,4, 78,5 ir 73,0 % tikslumą (3e pav.).PDPL specifiškumas patvirtina, kad PDPL yra ideali priemonė organelėms specifiniams proteomams nustatyti.Pažymėtina, kad identifikuotų mitochondrijų baltymų pateikimochondrinė analizė parodė, kad įstrigęs proteomas daugiausia buvo pasiskirstęs matricoje ir vidinėje membranoje (atitinkamai 226 ir 106), o tai sudaro 91, 7% (362) visų nustatytų mitochondrijų baltymų.papildomai buvo patvirtintas aukštas PDPL lygis (papildomas 7a pav.).Panašiai subnuklearinė analizė parodė, kad užfiksuotas proteomas daugiausia buvo pasiskirstęs branduolyje, nukleoplazmoje ir branduolyje (papildomas 7b pav.).Branduolinė proteominė analizė su branduolio lokalizacijos signalo peptidu (3xNLS) parodė panašų tikslumą kaip ir H2B konstruktas (papildomas 7c-h pav.).Norint nustatyti PDPL žymens specifiškumą, branduolinis lamininas A buvo pasirinktas kaip diskretiškiau lokalizuotas POI7 spąstai.PDPL nustatė 36 reikšmingai praturtintus baltymus, iš kurių 12 baltymų (30,0 %, įskaitant laminą A) buvo gerai apibūdinti lamina A sąveikaujantys baltymai, anotuoti String duomenų bazėje, kurių procentas didesnis nei BioID metodas (122 baltymai) 28 iš 28. , 22,9 %) 7. Mūsų metodas nustatė mažiau baltymų, galbūt dėl ​​ribotų ženklinimo sričių, o tai buvo įmanoma dėl aktyvesnio vienetinio deguonies.GO analizė parodė, kad nustatyti baltymai daugiausia buvo nukleoplazmoje (26), branduolinėje membranoje (10), branduolinėje membranoje (9) ir branduolinėse porose (5).Kartu šie branduolyje lokalizuoti baltymai sudarė 80% praturtintų baltymų, dar labiau įrodydami PDPL specifiškumą (papildomas 8a–d pav.).
Nustatę PDPL gebėjimą atlikti artumo žymėjimą organelėse, tada išbandėme, ar PDPL galima naudoti analizuojant POI surišimo partnerius.Visų pirma, mes siekėme apibrėžti citozolinių baltymų PDPL analizę, kurie dėl labai dinamiško pobūdžio laikomi sunkesniais tikslais nei jų membranoje lokalizuoti kolegos.Bromodomenas ir ekstratermininis (BET) baltymas BRD4 patraukė mūsų dėmesį dėl savo pagrindinio vaidmens sergant įvairiomis ligomis 35, 36 .BRD4 sudarytas kompleksas yra transkripcijos koaktyvatorius ir svarbus terapinis taikinys.Reguliuojant c-myc ir Wnt5a transkripcijos faktorių ekspresiją, manoma, kad BRD4 yra pagrindinis ūminės mieloidinės leukemijos (AML), daugybinės mielomos, Burkitt limfomos, gaubtinės žarnos vėžio ir uždegiminių ligų veiksnys 37, 38.Be to, kai kurie virusai, pavyzdžiui, papilomos virusas, ŽIV ir SARS-CoV-236,39, nukreipia BRD4, kad reguliuotų virusų ir ląstelių transkripciją.
Norėdami susieti BRD4 sąveiką naudodami PDPL, sujungėme miniSOG su trumpa BRD4 N arba C-galo izoforma.Proteominiai rezultatai atskleidė didelį dviejų konstrukcijų sutapimą (papildomas 9a pav.).Branduolinis proteomas, identifikuotas su miniSOG-H2B, apima 77,6% baltymų, sąveikaujančių su BRD4 (papildomas 9b pav.).Tada žymeklio spinduliui reguliuoti buvo naudojami skirtingi apšvietimo laikai (2, 5, 10, 20 min.) (4a pav. ir 3 papildomi duomenys).Darome išvadą, kad trumpesniais fotoperiodais PDPL pirmiausia žymės tiesioginius surišimo partnerius, o ilgesni laikotarpiai apims baltymus, identifikuotus per trumpesnius fotoaktyvacijos laikotarpius, taip pat netiesioginius taikinius ženklinimo kompleksuose.Tiesą sakant, mes nustatėme didelį gretimų laiko taškų sutapimą (84,6% 2 ir 5 min.; 87,7% 5 ir 10 min.; 98,7% 10 ir 20 min.) (4b pav. ir papildomas 9c pav.).Visose eksperimentinėse grupėse radome ne tik BRD4 savaiminį ženklinimą, bet ir keletą žinomų taikinių, tokių kaip MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A ir HMGB1, anotuotų eilučių duomenų bazėje.Šių taikinių joninė jėga yra proporcinga ekspozicijos laikui (4c pav. ir papildomas 9d pav.).2 minučių grupėje nustatytų baltymų GO analizė parodė, kad nustatyti baltymai buvo lokalizuoti branduolyje ir dalyvavo chromatino remodeliavime bei RNR polimerazės funkcijoje.Molekulinė baltymo funkcija buvo praturtinta chromatino surišimu arba transkripcijos koaktyvacija, atitinkančia BRD4 funkciją (4d pav.).Styginių duomenų bazėje įjungta baltymų sąveikos analizė atskleidė pirmąjį netiesioginės sąveikos tarp BRD4 ir HDAC šeima sąveikaujančių kompleksų, tokių kaip SIN3A, NCOR2, BCOR ir SAP130, lygį (4e pav. ir papildomas 9e pav.), atitinkančius BRD4 ir HDAC surišančius acetilintus histonus. ..Be to, reprezentatyvūs taikiniai, nustatyti LC-MS/MS, įskaitant Sin3A, NSUN2, Fus ir SFPQ, buvo patvirtinti Western blot metodu (4f pav.).Neseniai pranešta, kad trumpoji BRD4 izoforma sudaro branduolius, pasižyminčius skysčio ir skysčio fazės atskyrimo (LLPS) savybėmis.RNR surišantys baltymai Fus ir SFPQ tarpininkauja įvairių ląstelių procesų LLPS ir čia buvo identifikuoti kaip neužregistruoti BRD4 surišantys baltymai.Sąveika tarp BRD4 ir SFPQ buvo patvirtinta bendro imunoprecipitacijos (bendrai IP) eksperimentais (4g pav.), o tai rodo kitą BRD4 tarpininkaujamo skysčio ir skysčio fazės atskyrimo mechanizmą, kuris nusipelno tolesnio tyrimo.Visi šie rezultatai rodo, kad PDPL yra ideali platforma identifikuoti žinomus BRD4 sąveikaujančius ir nežinomus surišančius baltymus.
a Scheminis miniSOG tarpininkaujamo BRD4 artumo žymėjimo vaizdas, ekspozicijos laikas: 2, 5, 10 ir 20 min.b Baltymų sutapimas, nustatytas skirtingu apšvietimo laiku.HEK293T-miniSOG-BRD4 nustatytas baltymų praturtėjimas buvo statistiškai reikšmingas, palyginti su laukinio tipo HEK293T.c Jonų intensyvumas kiekybiškai įvertinant nepažymėtus tipinius žinomus BRD4 surišančius baltymus per nurodytą ekspozicijos laiką.n = 3 biologiškai nepriklausomi mėginiai.Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis.d 2 minučių grupėje nustatytų baltymų genų ontologinė analizė (GO).Pateikiami pirmieji dešimt GO terminų.Burbuliukai yra spalvoti pagal GO termino kategoriją, o burbulo dydis yra proporcingas kiekviename termine rastų baltymų skaičiui.e Baltymų, sąveikaujančių su BRD4, styginių analizė.Geltonieji apskritimai yra tiesioginiai klijai, o pilki apskritimai yra pirmasis netiesioginių klijų sluoksnis.Raudonos linijos žymi eksperimentiškai nustatytas sąveikas, o mėlynos linijos – numatomą sąveiką.f Reprezentatyvūs BRD4 surišimo taikiniai, nustatyti LC-MS / MS, buvo patikrinti Western blot metodu.g Bendro imunoprecipitacijos eksperimentai patvirtina SFPQ ir BRD4 sąveiką.Šie eksperimentai buvo nepriklausomai pakartoti mažiausiai du kartus su panašiais rezultatais.Neapdoroti duomenys pateikiami neapdorotų duomenų failų forma.
Be neregistruotų su POI susijusių taikinių nustatymo, mes manome, kad PDPL bus tinkamas fermentų substratams identifikuoti, todėl reikės apibūdinti netiesioginius surišančius baltymus dideliuose kompleksuose, kad būtų galima komentuoti neregistruotus substratus.Parkinas (koduojamas PARK2) yra E3 ligazė ir žinoma, kad parkin mutacijos sukelia autosominę recesyvinę jaunatvinę Parkinsono ligą (AR-JP)42.Be to, parkinas buvo aprašytas kaip būtinas mitofagijai (mitochondrijų autofagijai) ir reaktyviųjų deguonies rūšių pašalinimui.Tačiau, nors buvo nustatyti keli parkino substratai, parkino vaidmuo sergant šia liga lieka neaiškus.Norint komentuoti neapibūdintus substratus, PDPL buvo išbandytas pridedant miniSOG į parkino N arba C galą.Ląstelės buvo apdorotos karbonilo cianido protonų transporteriu m-chlorfenilhidrazonu (CCCP), kad suaktyvintų parkiną PINK1-Parkin keliu.Palyginti su mūsų BRD4 PDPL rezultatais, parkino N-galo suliejimas atskleidė didesnį tikslinių baltymų rinkinį, nors apėmė didesnę C-galo dalį (177 iš 210) (5a, b paveikslai ir 4 papildomi duomenys).rezultatas atitinka ataskaitas, kad N-galo žymės gali nenormaliai suaktyvinti Parkin44.Keista, kad mūsų duomenyse buvo tik 18 sutampančių baltymų su paskelbtais Parkin43 AP-MS rezultatais, greičiausiai dėl ląstelių linijų ir proteomikos darbo eigos skirtumų.Be keturių žinomų baltymų (ARDM1, HSPA8, PSMD14 ir PSMC3), nustatytų dviem metodais (5c pav.)43.Siekiant dar labiau patvirtinti LC-MS/MS rezultatus, buvo naudojamas PDPL gydymas ir vėlesnis Western blot tyrimas, siekiant palyginti HEK293T pirminių ląstelių tyrimo ir stabilios N-galinės parkinės linijos rezultatus.Anksčiau nežinomi taikiniai CDK2, DUT, CTBP1 ir PSMC4 buvo išbandyti su žinomu rišikliu DNAJB1 (5d pav.).
Su parkinu sąveikaujančių baltymų vulkaninis brėžinys HEK293T ląstelėse su stabiliai išreikštu miniSOG, susiliejusiu su parkino N arba C galu (n = 3 nepriklausomi biologiniai eksperimentai).Dviejų uodegų Studento t testas buvo naudojamas ugnikalnių sklypuose.HEK293T buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė. Ryškiai pakitę baltymai paryškinti raudonai (p < 0,05 ir >2 karto jonų intensyvumo skirtumas). Ryškiai pakitę baltymai paryškinti raudonai (p < 0,05 ir >2 karto jonų intensyvumo skirtumas). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 ir >2-кратная разница в интенсивности ионов). Ryškiai pakitę baltymai paryškinti raudonai (p < 0,05 ir > 2 kartų skirtumas tarp jonų intensyvumo).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Reikšmingai pakitę baltymai paryškinti raudonai (p < 0,05 ir > 2 kartų joninės stiprumo skirtumas).Susiję baltymai, svarbūs HEK293T-miniSOG, bet nėra svarbūs HEK293T, rodomi žaliai.b Venn diagrama, rodanti persidengiančius baltymus tarp N-galo ir C-galo konstrukcijų.N-galinės žymės gali nenormaliai suaktyvinti parkiną ir sukelti labiau atpažįstamus baltymus.c Venn diagrama, rodanti persidengiančius baltymus tarp PDPL ir AP-MS.Yra išvardyti žinomi sąveikos dalyviai, įskaitant 4 iš 18 persidengiančių baltymų ir 11 iš 159 baltymų, konkrečiai nustatytų PDPL.d Reprezentatyvūs taikiniai, nustatyti LC-MS/MS, buvo patikrinti Western blot metodu.e Ssu72 ir SNW1 buvo identifikuoti kaip neregistruoti parkino substratai.Šios FLAG pažymėtos baltymų plazmidės buvo transfekuotos į HEK293T ir HEK293T-Parkin-miniSOG, po to įvairiais laiko momentais buvo apdorotas CCCP.Degradacija buvo ryškesnė Parkino ekspresijos linijoje.f Naudojant proteasomos inhibitorių MG132, buvo patvirtinta, kad Ssu72 ir SNW1 skilimo procesą skatina proteasomų ubikvitinacija.Šie eksperimentai buvo nepriklausomai pakartoti mažiausiai du kartus su panašiais rezultatais.Neapdoroti duomenys pateikiami neapdorotų duomenų failų forma.
Pažymėtina, kad PDPL nustatyti baltymai turi apimti parkiną surišančius baltymus ir jų substratus.Norėdami aptikti neregistruotus parkino substratus, pasirinkome septynis identifikuotus baltymus (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 ir SNW1) ir transfekuotas plazmides, kad šie genai būtų veikiami normaliu HEK293T ir stabiliai ekspresuotų miniSOG-Parkin's, po kurio buvo atliktas gydymas HEK293.Ssu72 ir SNW1 baltymų lygis buvo žymiai sumažintas stabilioje miniSOG-Parkin linijoje (5e pav.).Gydymas CCCP 12 valandų sukėlė didžiausią abiejų substratų degradaciją.Norint ištirti, ar Ssu72 ir SNW1 skilimą reguliuoja proteasomų ubikvitinacija, buvo pridėtas proteasomos inhibitorius MG132, kuris slopintų proteasomų aktyvumą, ir iš tikrųjų mes nustatėme, kad jų skilimo procesas buvo slopinamas (5f pav.).Papildomi ne substratiniai taikiniai buvo patvirtinti kaip Parkin sąveikaujantys asmenys, naudojant Western blot metodą (papildomas 10 pav.), kuris parodė nuoseklius rezultatus naudojant LC-MS/MS.Apibendrinant galima pasakyti, kad PDPL darbo eigos integravimas su tikslinių baltymų transfekcijos patikrinimu leidžia identifikuoti neregistruotus E3 ligazės substratus.
Sukūrėme bendrą artumo žymėjimo platformą, kuri leidžia identifikuoti erdvėje ir laike sąveikaujančius POI.Platforma yra pagrįsta miniSOG fotosensibilizatoriaus baltymu, kuris yra tik apie 12 kDa, mažiau nei perpus mažesnis už subrendusio APEX2 fermento dydį (27 kDa) ir trečdalį TurboID dydžio (35 kDa).Mažesnis dydis turėtų labai išplėsti mažų baltymų interaktomų tyrimo taikymo sritį.Norint padidinti vienetinio deguonies kiekį ir išplėsti šio metodo jautrumą, reikia toliau tirti papildomus fotosensibilizatorius, nesvarbu, ar tai būtų genetiškai užkoduoti baltymai, ar mažos molekulės.Dabartinėje miniSOG versijoje didelę laiko skiriamąją gebą galima pasiekti naudojant mėlyną apšvietimą, kad būtų suaktyvinti artumo žymekliai.Be to, ilgesnis ekspozicijos laikas išlaisvino didesnį pavienio deguonies „debesį“, dėl kurio pasikeitė daugiau distalinių histidino likučių, padidėjo ženklinimo spindulys ir buvo galimybė tiksliai sureguliuoti PDPL erdvinę skiriamąją gebą.Mes taip pat išbandėme septynis cheminius zondus, kad padidintume signalo ir fono santykį, ir ištyrėme šio metodo molekulinį mechanizmą.TOP-ABPP darbo eiga kartu su nešališka atvira paieška patvirtino, kad modifikacijos įvyko tik histidinuose ir nepastebėta nuoseklios mikroaplinkos dėl padidėjusių histidino modifikacijų, išskyrus vidutinę histidinų pirmenybę kilpos srityje.
PDPL taip pat buvo naudojamas apibūdinti tarpląstelines proteomas, kurių proteomų specifiškumas ir aprėptis yra bent jau palyginami su kitais artumo žymėjimo ir organeliams būdingais cheminio zondo metodais.Artumo žymenys taip pat buvo sėkmingai naudojami apibūdinti paviršiaus, lizosomų ir su sekrecija susijusias proteomas 46, 47.Manome, kad PDPL bus suderinamas su šiomis tarpląstelinėmis organelėmis.Be to, mes metėme iššūkį PDPL, nustatydami citozolinių baltymų surišimo taikinius, kurie yra sudėtingesni nei su membrana sujungti baltymai dėl jų dinaminių savybių ir dalyvavimo labiau laikinoje sąveikoje.PDPL buvo pritaikytas dviem baltymams – transkripcijos koaktyvatoriui BRD4 ir su liga susijusiai ligazei E3 Parkin.Šie du baltymai buvo pasirinkti ne tik dėl jų pagrindinių biologinių funkcijų, bet ir dėl klinikinės svarbos bei terapinio potencialo.Šioms dviem POI buvo nustatyti gerai žinomi privalomi partneriai ir neregistruoti tikslai.Pažymėtina, kad su fazių atskyrimu susijusį baltymą SFPQ patvirtino ko-IP, o tai gali rodyti naują mechanizmą, kuriuo BRD4 (trumpoji izoforma) reguliuoja LLPS.Tuo pačiu metu manome, kad Parkin substratų identifikavimas yra scenarijus, kai reikia identifikuoti netiesioginius klijus.Mes nustatėme du neatpažintus parkino substratus ir patvirtinome jų skilimą ubikvitinacijos-proteasomų keliu.Neseniai buvo sukurta mechanizmu pagrįsta gaudymo strategija, skirta aptikti hidrolazės substratus sulaikant juos fermentais.Nors tai labai galingas metodas, jis netinka substratų, dalyvaujančių didelių kompleksų susidaryme, analizei ir reikalauja kovalentinių ryšių tarp fermento ir substrato susidarymo.Tikimės, kad PDPL gali būti išplėstas tiriant kitus baltymų kompleksus ir fermentų šeimas, tokias kaip deubikvitinazės ir metaloproteazės šeimos.
Sukurta nauja miniSOG forma, vadinama SOPP3, su patobulinta deguonies gamyba.Palyginome miniSOG su SOPP3 ir nustatėme pagerėjusią žymėjimo našumą, nors signalo ir triukšmo santykis nepasikeitė (papildomas 11 pav.).Iškėlėme hipotezę, kad SOPP3 optimizavimas (pvz., per kryptingą evoliuciją) sukels efektyvesnius fotosensibilizatorius, kuriems reikalingas trumpesnis šviesos laikas ir todėl būtų galima užfiksuoti dinamiškesnius ląstelių procesus.Pažymėtina, kad dabartinė PDPL versija yra skirta tik ląstelių aplinkai, nes jai reikalingas mėlynos šviesos apšvietimas ir ji negali prasiskverbti į gilius audinius.Ši savybė neleidžia jo naudoti atliekant gyvūnų modelių tyrimus.Tačiau optogenetikos derinys su PDPL galėtų suteikti galimybę atlikti tyrimus su gyvūnais, ypač smegenyse.Be to, šį apribojimą panaikina ir kiti infraraudonųjų spindulių fotosensibilizatoriai.Šiuo metu šioje srityje atliekami tyrimai.
HEK293T ląstelių linija buvo gauta iš ATCC (CRL-3216).Ląstelių linija buvo neigiama dėl mikoplazmos infekcijos ir buvo auginama DMEM (Thermo, #C11995500BT), papildytu 10% galvijų vaisiaus serumo (FBS, Vistech, #SE100-B) ir 1% penicilino / streptomicino (Hyclone, #SV30010).užaugę.
3-aminofenilenas (3 mėginys) ir (4-etinilfenil)metanaminas (4 mėginys) buvo įsigyti iš Bidepharm.Propilaminas (zondas 2) buvo nupirktas iš Energy-chemicals.N-(2-aminofenil)pent-4-inamidas (zondas 1) buvo susintetintas publikuotais metodais.
1 papildomoje lentelėje išvardyti šiame tyrime naudojami genetiniai konstruktai.MiniSOG ir KillerRed sekos buvo klonuotos iš P. Zou (Pekino universitetas) dovanotos plazmidės.Mitochondrijų matricos taikymo seka buvo gauta iš 23 COX4 N-galinių aminorūgščių ir klonuota į nurodytus vektorius, naudojant Gibson agregatą (Beyotime, #D7010S).Norėdami nukreipti į endoplazminio tinklo membraną ir branduolį, SEC61B žmogaus DNR (NM_006808.3) (NEB, #M0491L), amplifikuota PGR būdu iš HEK293T ląstelių cDNR bibliotekos, ir H2B DNR (padovanota D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) ir klonuotas, kaip minėta aukščiau.Jei nenurodyta kitaip, kiti baltymų genai, naudojami transfekcijai ir stabilių ląstelių linijų konstravimui, buvo amplifikuoti iš HEK293T ląstelių cDNR bibliotekos PGR.G3S (GGGS) ir G4S (GGGGS) buvo naudojami kaip jungikliai tarp masalo baltymo ir miniSOG.Prie šių sintezės konstrukcijų buvo pridėta V5 epitopo žyma (GKPIPNPLLGLDST).Ekspresijai žinduoliuose ir stabiliai ląstelių linijai sukurti miniSOG suliejimo konstrukcija buvo subklonuota į pLX304 lentivirusinį vektorių.Bakterijų ekspresijai miniSOG buvo klonuotas į pET21a vektorių, pažymėtą 6xHis C-gale.
HEK293T ląstelės buvo pasėtos po 2,0 x 105 ląstelių viename šulinyje į šešių šulinėlių plokšteles ir po 24 valandų transfekuotos rekombinantinėmis lentivirusinėmis plazmidėmis (2,4 μg pLX304) ir viruso pakavimo plazmidėmis (1,5 μg psPAX2 ir 1,2 μg 0,2 μg psPAX2 ir 1,2 μg0g p0MDBeyo8time), naudojant p0MDBeyo8. , #C0533), apie 80 % sintezės.Po nakties transfekcijos terpė buvo pakeista ir inkubuojama dar 24 valandas.Virusas buvo surinktas po 24, 48 ir 72 valandų.Prieš užkrečiant tikslines ląstelių linijas, virusinė terpė buvo filtruojama per 0, 8 μm filtrą (Merck, #millex-GP) ir buvo pridėta polibreno (Solarbio, # H8761) iki 8 μg / ml koncentracijos.Po 24 valandų ląstelėms buvo leista atsigauti pakeitus terpę.Ląstelės buvo atrinktos naudojant 5 μg/ml blasticidiną (Solarbio, #3513-03-9) pirmiesiems trims pasažams kaip žemesnio griežtumo atranką.Tada naudojo 20 μg/ml kaip griežtesnį režimą kitiems trims pasažams.
Ląstelės buvo sėjamos į 12 šulinėlių kameras (Ibidi, #81201), kurių tankis buvo maždaug 20 000 ląstelių viename šulinyje.Norėdami pagerinti HEK293T ląstelių sukibimą, įpilkite 50 µg/ml fibronektino (Corning, #356008), praskiesto fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS, Sangon, #B640435) 37 °C temperatūroje.Kameros buvo iš anksto apdorotos 1 valandą, o po to pašalintos PBS.Po 24 valandų ląstelės vieną kartą plaunamos PBS, inkubuojamos su 1 mM zondu 3 šviežiame Hankso subalansuotame druskos tirpale (HBSS, Gibco, #14025092) 1 valandą 37 °C temperatūroje, o po to inkubuojamos su mėlynu šviesos diodu (460 nm). ).) buvo apšvitinti 10 minučių kambario temperatūroje.Po to ląstelės du kartus plaunamos PBS ir fiksuojamos 4% formaldehidu PBS (Sangon, #E672002) 15 minučių kambario temperatūroje.Formaldehido perteklius buvo pašalintas iš fiksuotų ląstelių tris kartus plaunant PBS.Tada ląstelės buvo permeabilizuotos 0,5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) PBS ir 3 kartus plaunamos PBS.Tada išimkite kamerą ir į kiekvieną mėginį įpilkite po 25 µl „click“ reakcijos mišinio, kuriame yra 50 µM Cy3-azido (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4). ir 0,5 mg/ml natrio askorbato (Aladdin, Nr. S105024) ir inkubuojamas 30 minučių kambario temperatūroje.Po snap reakcijos ląstelės šešis kartus plaunamos PBS, turinčiu 0,05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST), o po to blokuojamos 5% BSA (Abcone, #B24726) PBST 30 minučių kambario temperatūroje.
Kolokalizacijos imuniniam dažymui ląstelės buvo inkubuojamos su pirminiais antikūnais pagal nurodytas sąlygas: pelės anti-V5 žymės mAb (1:500, CST, #80076), triušio anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABkloninis, #A0564), triušio polikloninis anti-kalneksino antikūnas (1:500, Abcam, #ab22595) arba triušio anti-lamino A/C monokloninis antikūnas (1:500; CST, #2032) 4 °C temperatūroje per naktį.Po 3 kartų plovimo PBST ląstelės buvo inkubuojamos su antriniais antikūnais: ožkos anti-triušio Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034), praskiestu santykiu 1:1000, ožkų anti-pelės Alexa Fluor 594 (CST, #8889), praskiestu santykiu 1:100.praskiedimas Skiedžiama kambario temperatūroje 30 minučių.Po to ląstelės 3 kartus plaunamos PBST ir 10 minučių kambario temperatūroje buvo nudažytos DAPI (Thermo, # D1306) PBS.Po 3 plovimų PBS ląstelės buvo uždarytos 50% gliceroliu (Sangon, #A600232) PBS, kad būtų galima gauti vaizdą.Imunofluorescenciniai vaizdai buvo gauti naudojant ZEISS LSM 900 Airyscan2 konfokalinį mikroskopą ir ZNE 3.5 programinę įrangą.
Vienkartiniam deguonies fluorescenciniam vaizdavimui ląstelės buvo du kartus plaunamos Hanks HEPES buferiu, prieš įdedant 100 nM Si-DMA Hanks HEPES buferyje (DOJINDO, # MT05).Po šviesos poveikio ląstelės buvo inkubuojamos CO2 inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje 45 minutes.Tada ląstelės buvo du kartus plaunamos Hanks HEPES buferiu ir prieš dažytos Hoechst Hanks HEPES buferyje 10 minučių kambario temperatūroje ir vizualizuotos naudojant ZEISS LSM 900 konfokalinį mikroskopą., #M36008) HBSS buferyje, kuriame yra kalcio ir magnio.Po poveikio šviesai arba doksorubicinui (MCE, #HY-15142A), ląstelės buvo inkubuojamos CO2 inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje 10 minučių, du kartus plaunamos HBSS buferiu ir inkubuojamos su Hoechst HBSS buferyje kambario temperatūroje.minučių.Doksorubicinas buvo naudojamas kaip teigiama zondo kontrolė, kai ląstelės buvo apdorotos 20 μM doksorubicinu HBSS, kuriame yra 1% BSA, 30 minučių.Imunofluorescenciniai vaizdai buvo gauti naudojant Zeiss LSM 900 konfokalinį mikroskopą.
HEK293T ląstelės, stabiliai ekspresuojančios mito-miniSOG, buvo pasėtos maždaug 30% tankiu 15 cm induose.Po 48 valandų, kai buvo pasiektas ~80% susiliejimas, ląstelės vieną kartą plaunamos PBS, inkubuojamos su 1 mM zondu 3 šviežiame HBSS buferyje 1 valandą 37 °C temperatūroje ir po to 10 minučių kambaryje apšviečiamos mėlynu šviesos diodu. temperatūros..Po to ląstelės du kartus plaunamos PBS, nugramdomos ir resuspenduojamos lediniame PBS buferyje, kuriame yra proteazės inhibitorių be EDTA (MCE, #HY-K0011).Ląstelės buvo lizuojamos ultragarsu apdorojus galiuką 1 minutę (1 sekundė įjungta ir 1 sekundė išjungta esant 35% amplitudei).Gautas mišinys buvo centrifuguojamas 15 871 xg 10 minučių 4 ° C temperatūroje, kad būtų pašalintos šiukšlės, o supernatanto koncentracija buvo sureguliuota iki 4 mg / ml, naudojant BCA baltymų tyrimo rinkinį (Beyotime, #P0009).Sumaišykite 1 ml aukščiau pateikto lizato su 0,1 mM fotodegraduojančiu biotino azidu (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM TBTA ligandu (Aladdin, #T162437) ir 1 mM CuSO4 inkubatoriumi su dugnu. pasukti iki 1 valandos kambario temperatūroje.Po greitos reakcijos mišinį įpilkite į iš anksto sumaišytą tirpalą (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) 10 ml stikliniame buteliuke.Mėginiai buvo sumaišyti ir centrifuguojami esant 4500 g 10 minučių kambario temperatūroje.Apatinis ir viršutinis tirpalai buvo išmesti, nuosėdos du kartus plaunamos 1 ml metanolio ir centrifuguojamos 15 871 × g 5 minutes 4 ° C temperatūroje.Įpilkite 1 ml 8 M karbamido (Aladdin, Nr. U111902) 25 mM amonio bikarbonate (ABC, Aladdin, Nr. A110539), kad ištirpintumėte nuosėdas.Mėginiai buvo atkuriami 10 mM ditiotreitoliu (Sangon, #A100281 25 mM ABC) 40 minučių 55 °C temperatūroje, po to įpilama 15 mM šviežio jodoacetamido (Sangon, #A600539) kambario temperatūroje tamsoje.Alkilinimas per 30 minučių..Reakcijai sustabdyti buvo pridėta papildomai 5 mM ditiotreitolio.Kiekvienam mėginiui paruoškite maždaug 100 µl NeutrAvidin agarozės granulių (Thermo, #29202), plaudami 3 kartus 1 ml PBS.Aukščiau pateiktas proteomo tirpalas buvo praskiestas 5 ml PBS ir inkubuojamas su iš anksto išplautomis NeutrAvidin agarozės granulėmis 4 valandas kambario temperatūroje.Tada granulės buvo plaunamos 3 kartus su 5 ml PBS, turinčiu 0,2% SDS (Sangon, #A600485), 3 kartus su 5 ml PBS, turinčiu 1 M karbamido, ir 3 kartus su 5 ml ddH2O.Tada karoliukai buvo nuimami centrifuguojant ir resuspenduojami 200 μl 25 mM ABC, kuriame yra 1 M karbamido, 1 mM CaCl2 (Macklin, #C805228) ir 20 ng/μl tripsino (Promega, # V5280).Tripsinuokite per naktį 37 °C temperatūroje sukant.Reakcija buvo sustabdyta pridedant skruzdžių rūgšties (Thermo, # A117-50), kol pH pasiekė 2-3.Karoliukai buvo plaunami 3 kartus su 1 ml PBS, kuriame yra 0, 2% SDS, 3 kartus su 1 ml PBS, kuriame yra 1 M karbamido, ir 3 kartus su 1 ml distiliuoto vandens.Modifikuoti peptidai buvo atpalaiduoti lengvos lizės būdu (365 nm) 90 minučių, naudojant 200 μl 70% MeOH.Po centrifugavimo supernatantas buvo surinktas.Tada granulės vieną kartą plaunamos 100 μl 70% MeOH ir supernatantai buvo sujungti.Mėginiai buvo išdžiovinti Speedvac vakuuminiame koncentratoriuje ir iki analizės laikomi -20 °C temperatūroje.
Norint nustatyti ir kiekybiškai įvertinti pavienius deguonies modifikuotus peptidus, mėginiai buvo ištirpinti 0, 1% skruzdžių rūgštyje ir 1 μg peptidų buvo ištirta naudojant Orbitrap Fusion Lumos Tribrid masės spektrometrą, aprūpintą nano ESI šaltiniu iš Tune ir Xcalibur iš gamintojo programinės įrangos 4.3.Mėginiai buvo atskirti ant 75 µm × 15 cm viduje supakuotos kapiliarinės kolonėlės su 3 µm C18 medžiaga (ReproSil-pur, #r13.b9.) ir prijungta prie EASY-nLC 1200 UHPLC sistemos (Thermo).Peptidai buvo atskirti tiesine 95 minučių gradiento chromatografija nuo 8% tirpiklio B iki 50% tirpiklio B (A = 0,1% skruzdžių rūgšties vandenyje, B = 0,1% skruzdžių rūgšties 80% acetonitrile), tada tiesiškai padidinta iki 98% B min. per 6 min, kai srautas yra 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos pakaitomis renka duomenis iš viso MS nuskaitymo ir MS2 nuskaitymo, priklausomai nuo duomenų.Purškimo įtampa nustatyta 2,1 kV, o jonų pernešimo kapiliaro temperatūra – 320°C.MS spektrai (350-2000 m/z) buvo renkami 120 000 skiriamąja geba, AGC 4 × 105, o maksimali įvesties trukmė – 150 ms.10 labiausiai paplitusių daugkartinio krūvio pirmtakų kiekviename pilname skenavime buvo suskaidyti naudojant HCD, kurio normalizuota susidūrimo energija buvo 30%, kvadrupolio izoliacijos langas 1, 6 m / z ir 30 000 skiriamosios gebos nustatymas.AGC taikinys, skirtas tandeminei masės spektrometrijai, naudojant 5 × 104 ir didžiausią įvesties laiką 150 ms.Dinaminė išimtis nustatyta į 30 sekundžių. Nepriskirti jonai arba tie, kurių krūvis yra 1+ ir >7+, buvo atmesti MS/MS. Nepriskirti jonai arba tie, kurių krūvis yra 1+ ir >7+, buvo atmesti MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ ir >7+ были отклонены для МС/МС. Nepriskirti jonai arba jonai, kurių krūvis yra 1+ ir >7+, buvo atmesti MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Nepatikslinti jonai arba jonai, kurių krūviai yra 1+ ir >7+, buvo atmesti MS/MS.
Neapdoroti duomenys apdorojami naudojant FragPipe skaičiavimo platformą, pagrįstą MSFragger.Masės paklaidos ir atitinkamos aminorūgštys buvo nustatytos naudojant atvirą paieškos algoritmą, kurio pirmtakų masės tolerancija nuo -150 iki 500 Da.Tada modifikuoti peptidai buvo identifikuoti naudojant histidino modifikacijas, kurių masės padidėjimas buvo +229,0964 ir +247,1069 Da PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Ląstelės, stabiliai ekspresuojančios sulietą miniSOG geną, buvo dedamos į 6 cm lėkštes.Pasiekusios ~ 80% susiliejimą, ląstelės vieną kartą plaunamos HBSS (Gibco, #14025092), po to inkubuojamos su cheminiais zondais HBSS 1 valandą 37 °C temperatūroje ir apšviestos mėlyna šviesa.10 W LED lemputė 20 minučių kambario temperatūroje.Norint nustatyti, kokio tipo reaktyviosios deguonies rūšys dalyvauja PDPL, 0,5 mM vitamino C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), Į ląsteles kaip papildų buvo pridėta 100 mM manitolio (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3.Po plovimo šaltu PBS, ląstelės buvo subraižytos, surenkamos į 1, 5 ml centrifugos mėgintuvėlius ir 1 minutę ultragarsu apdorojamos 200 μl PBS su 1x proteazės inhibitoriumi be EDTA (1 s ir 1 s be, amplitudė 35%).Gautas mišinys buvo centrifuguojamas 15 871 × g greičiu 10 minučių 4 ° C temperatūroje, o supernatanto koncentracija buvo sureguliuota iki 1 mg / ml, naudojant BCA baltymų tyrimo rinkinį.Maždaug 50 µl aukščiau nurodyto lizato buvo inkubuojami su 0,1 mM rodamino azidu (Aladdin, Nr. T131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA ligandu ir 1 mM CuSO4 1 valandą kambario temperatūroje, sukant iš apačios į viršų.Po paspaudimo reakcijos nusodinimas acetonu buvo atliktas į mėginius įpilant 250 μl iš anksto atšaldyto acetono, 20 minučių inkubuojant -20 ° C temperatūroje ir centrifuguojant 6010 × g 10 minučių 4 ° C temperatūroje.Surinkite nuosėdas ir virkite 50 µl 1x Laemmli buferio 10 minučių 95 °C temperatūroje.Tada mėginiai buvo analizuojami ant SDS-PAGE ilgų gelių ir vizualizuoti naudojant Bio-rad ChemiDoc MP Touch vaizdo gavimo sistemą su Image Lab Touch programine įranga.
Rekombinantinio miniSOG-6xHis baltymo ekspresija ir gryninimas buvo atliktas taip, kaip aprašyta anksčiau.Trumpai tariant, E. coli BL21(DE3) ląstelės (TransGen, #CD701-02) buvo transformuotos pET21a-miniSOG-6xHis ir baltymų ekspresija buvo sukelta 0,5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Po ląstelių lizės baltymai buvo išgryninti naudojant Ni-NTA agarozės granules (MCE, Nr. 70666), dializuojami prieš PBS ir laikomi –80 °C temperatūroje.
Norėdami atlikti antikūnais pagrįstą in vitro etiketės artumo tyrimą, sumaišykite 100 μM išgryninto miniSOG, 1 mM zondo 3 ir 1 μg anti-žymėjimo pelės monokloninį antikūną (TransGen, #HT501-01) PBS, kad bendras reakcijos tūris būtų 50 μl..Reakcijos mišinys buvo apšvitintas mėlyna LED šviesa 0, 2, 5, 10 ir 20 minučių kambario temperatūroje.Mišinys buvo inkubuojamas su 0,1 mM biotino-PEG3-azidu (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA ligandu ir 1 mM CuSO4 1 valandą kambario temperatūroje ant aukštyn judančio kratytuvo.Po greitos reakcijos į mišinį įpilkite 4x Laemmli buferio ir virkite 95 °C temperatūroje 10 min.Mėginiai buvo analizuojami SDS-PAGE geliais ir analizuojami Western blot metodu su streptavidinu-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Histidino turintis sintetinis peptidas su C-galo amidavimu (LHDALDAK-CONH2) buvo naudojamas netoliese esančio peptido ženklinimui in vitro analizuoti.Šiame tyrime PBS buvo sumaišyta 100 μM išgryninto miniSOG, 10 mM zondo 3 ir 2 μg/ml sintetinio peptido, kurio bendras reakcijos tūris buvo 50 μl.Reakcijos mišinys buvo apšvitintas mėlyna LED šviesa 1 valandą kambario temperatūroje.Vienas mikrolitras mėginio buvo ištirtas naudojant LC-MS sistemą (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight masės spektrometrą su MassLynx spektro analizės programine įranga).
HEK293T ląstelės, stabiliai ekspresuojančios miniSOG suliejimo geną, buvo pasėtos į 10 cm lėkštes skirtingos organelių lokalizacijos linijoms (Mito, ER, Nucleus) ir 15 cm indelius Parkin-miniSOG ir BRD4-miniSOG linijoms.Pasiekusios ~ 90% susiliejimą, ląstelės vieną kartą plaunamos HBSS, po to inkubuojamos su zondu 3 HBSS 1 valandą 37 ° C temperatūroje ir kambario temperatūroje apšviečiamos 10 W mėlynu šviesos diodu.Nekontaktiniam Parkin žymėjimui 1 valandai 37 °C temperatūroje buvo pridėta 10 µM protonų karbonilo cianido nešiklio m-chlorfenilhidrazono CCCP (Solarbio, #C6700) su 3 zondu HBSS.Ląstelių lizės, paspaudimo chemijos, redukcijos ir alkilinimo etapai buvo tokie patys, kaip aprašyta aukščiau, išskyrus tai, kad buvo pridėta 2 mg lizato ir paspaudimo reakcijoje vietoj fotoskaidomo biotino azido buvo naudojamas biotino PEG3 azidas.Po sodrinimo granulės buvo plaunamos 3 kartus 5 ml PBS, turinčio 0, 2% SDS, 3 kartus 5 ml PBS, turinčio 1 M karbamido, ir 3 kartus 5 ml PBS.Po to 2 µg tripsino buvo pridėta prie 300 µl 25 mM ABC, turinčio 1 M karbamido, kad baltymas būtų suskaidytas per naktį 37 ° C temperatūroje.Reakcija buvo sustabdyta pridedant skruzdžių rūgšties, kol pasiekiamas pH 2-3.Po tripsinizacijos ant granulių peptido tirpalas buvo nusūdytas naudojant SOLAµ HRP kolonėlę (Thermo, #60209-001) ir išdžiovintas Speedvac vakuuminiame koncentratoriuje.Peptidai buvo ištirpinti 0, 1% skruzdžių rūgštyje ir 500 ng peptidų buvo analizuojami naudojant Orbitrap Fusion Lumos Tribrid masės spektrometrą, aprūpintą aukščiau aprašytu nano-ESI šaltiniu.Peptidai buvo atskirti komercinėse RP-HPLC pirminėse kolonėlėse (75 μm x 2 cm) (Thermo, Nr. 164946) ir analitinėse RP-HPLC kolonėlėse (75 μm x 25 cm) (Thermo, Nr. 164941), abiejose užpildytos 2 μm.gradientas nuo 8% iki 35% ACN per 60 minučių, tada tiesiškai padidintas iki 98% B per 6 minutes, kai srautas yra 300 Nl/min.MS spektrai (350-1500 m/z) buvo renkami su 60 000 skiriamąja geba, AGC 4 × 105, o maksimali įvesties trukmė – 50 ms.Atrinkti jonai buvo nuosekliai suskaidyti HCD 3 s ciklais, kai normalizuota susidūrimo energija 30%, kvadrupolio izoliacijos langas 1,6 m/z ir 15000 skiriamoji geba. 5 × 104 tandeminio masės spektrometro AGC taikinys ir didžiausia įpurškimo trukmė buvo panaudota 22 ms.Dinaminis išskyrimas nustatytas į 45 sekundes. Nepriskirti jonai arba tie, kurių krūvis yra 1+ ir >7+, buvo atmesti MS/MS. Nepriskirti jonai arba tie, kurių krūvis yra 1+ ir >7+, buvo atmesti MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ ir >7+ были отклонены для МС/МС. Nepriskirti jonai arba jonai, kurių krūvis yra 1+ ir >7+, buvo atmesti MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Nepatikslinti jonai arba jonai, kurių krūviai yra 1+ ir >7+, buvo atmesti MS/MS.
Mėginio paruošimo etapai iki NeutrAvidin granulių sodrinimo buvo tokie patys, kaip ir aukščiau aprašytoje LC-MS/MS analizėje.Maždaug 50 μg lizato buvo naudojama kaip įvestis pakrovimo kontrolei, o 2 mg lizato buvo panaudota paspaudimų reakcijoms.Po sodrinimo ir plovimo neutravidinu, surišti baltymai buvo eliuuojami į agarozės dervos granules įpilant 50 μl Laemmli buferio ir verdant 95 °C temperatūroje 5 minutes.Kontrolinės apkrovos įvestis ir granulėmis praturtinti mėginiai buvo išanalizuoti SDS-PAGE ir perkelti į PVDF membranas (Millipore, #ISEQ00010) standartiniais Western blot metodais.Membranos buvo užblokuotos 5% nugriebtu pienu (Sangon, #A600669) TBS, kuriame yra 0,1% tween-20 (TBST), ir nuosekliai inkubuojamos su pirminiais ir antriniais antikūnais.Pirminiai antikūnai buvo atskiesti 1:1000 5% nugriebtu pienu TBST ir inkubuojami per naktį 4 ° C temperatūroje.Antriniai antikūnai buvo naudojami santykiu 1:5000 ir inkubuojami 1 valandą kambario temperatūroje.Membranos buvo vizualizuotos chemiliuminescencija naudojant Chemidoc MP vaizdo gavimo sistemą.Visi nesupjaustyti dėmių ir gelių nuskaitymai paveiksle pateikiami kaip neapdoroti duomenys.
Šiame tyrime naudojami pirminiai antikūnai buvo triušio anti-SFPQ monokloninis antikūnas (CST, Nr. 71992), triušio anti-FUS monokloninis antikūnas (CST, Nr. 67840), triušio anti-NSUN2 polikloninis antikūnas (Proteintech, Nr. 20854-1-). AP), triušio anti-mSin3A polikloninis antikūnas (Abcam, #ab3479), pelės anti-žyminis monokloninis antikūnas (TransGen, #HT201-02), pelės anti-β-aktino monokloninis antikūnas (TransGen, #HC201-01), triušio antikūnas - CDK2 monokloninis antikūnas (ABclonal, #A0094), triušio monokloninis antikūnas prieš CTBP1 (ABclonal, #A11600), triušio polikloninis antikūnas prieš DUT (ABclonal, #A2901), triušio polikloninis antikūnas prieš PSMC4 (ABclonal, #A2 anti-05), #A2 anti-05 DNAJB1 polikloninis antikūnas (ABclonal, # A5504).Šie antikūnai buvo naudojami 1:1000 praskiedimu 5% nugriebto pieno TBST.Antriniai antikūnai, naudojami šiame tyrime, buvo anti-triušio IgG (TransGen, #HS101-01), anti-pelės IgG (TransGen, #HS201-01), praskiedus 1:5000.
Norint toliau ištirti, ar BRD4 sąveikauja su SFPQ, stabilios HEK293T ir BRD4-miniSOG ląstelės, per daug ekspresuojančios HEK293T, buvo dedamos į 10 cm indus.Ląstelės buvo plaunamos šaltu PBS ir lizuojamos 1 ml Pierce IP lizės buferyje (Thermo Fisher, #87787) su proteazės inhibitoriumi be EDTA 30 minučių 4 ° C temperatūroje.Po to lizatai buvo surinkti į 1, 5 ml centrifugavimo mėgintuvėlius ir centrifuguojami 15 871 xg 10 minučių 4 ° C temperatūroje.Supernatantas buvo paimtas ir inkubuojamas su 5 µg anti-V5 žymėto pelės monokloninio antikūno (CST, #80076) per naktį 4 °C temperatūroje.Du kartus nuplaukite maždaug 50 µl proteino A/G magnetinių granulių (MCE, #HY-K0202) su PBS, kuriame yra 0,5 % Tween-20.Tada ląstelių lizatai buvo inkubuojami su magnetinėmis granulėmis 4 valandas 4 ° C temperatūroje, sukant iš apačios į viršų.Tada karoliukai keturis kartus plaunami 1 ml PBST buferio ir virinami 95 ° C temperatūroje 5 minutes.Mėginiai buvo analizuojami SDS-PAGE geliais ir perkelti į PVDF membranas naudojant standartinius Western blot metodus.Membranos buvo užblokuotos 5% nugriebtame piene TBST ir nuosekliai inkubuojamos su pirminiais ir antriniais antikūnais.Pirminis antikūnas Triušio anti-SFPQ monokloninis antikūnas (CST, #71992) buvo naudojamas santykiu 1:1000 5% nugriebtame piene TBST ir inkubuojamas per naktį 4 °C temperatūroje.Anti-triušio IgG buvo naudojamas santykiu 1:5000 ir inkubuojamas 1 valandą kambario temperatūroje.Membranos buvo vizualizuotos chemiliuminescencija naudojant Chemidoc MP vaizdo gavimo sistemą.
Visos struktūros, naudojamos tirpikliui prieinamo paviršiaus ploto (SASA) analizei, buvo gautos iš baltymų duomenų banko (PDB)52 arba AlphaFold baltymų struktūrų duomenų bazės53.Absoliutus SASA buvo apskaičiuotas kiekvienam likučiui naudojant FreeSASA programą.Norint gauti vidutinį SASA kiekvienai struktūrai, buvo naudojami tik išsamūs ir nedviprasmiški žymėto histidino ir jo kaimynų SASA duomenys.Santykinis tirpiklio prieinamumas (RSA) kiekvienam histidinui buvo apskaičiuotas padalijus absoliučią SASA vertę iš empirinio didžiausio galimo tirpiklio likučių paviršiaus ploto.Tada visi histidinai buvo klasifikuojami kaip paslėpti, jei vidutinis RSA buvo mažesnis nei 20%, kitaip veikiamas56.
Neapdorotų failų, gautų DDA režimu, buvo ieškoma naudojant Proteome Discoverer (v2.5) arba MSfragger (Fragpipe v15.0) atitinkamoje SwissProt patikrintoje baltymų duomenų bazėje, kurioje yra įprastų teršalų.Peptidams reikėjo visiško tripsino su dviem trūkstamomis skilimo vietomis, karbamoilo metilinimas kaip fiksuota modifikacija ir metionino oksidacija kaip dinaminė modifikacija.Pirmtakų ir fragmentų svorio tolerancijos buvo nustatytos atitinkamai 10 ppm ir 0, 02 Da (MS2 Orbitrap). Buvo pašalinti teršalų taškai, o baltymai filtruojami, kad klaidingų atradimų dažnis būtų <1%. Buvo pašalinti teršalų taškai, o baltymai filtruojami, kad klaidingų atradimų dažnis būtų <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэфнифщих коэфнифулицо%. Teršalų taškai buvo pašalinti, o baltymai filtruojami, kad klaidingai aptiktų <1 proc.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率. <1%的错误发现率. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложнинху1 ложнины%. Teršalų taškai buvo pašalinti, o baltymai filtruojami, kad būtų pasiektas <1% klaidingas teigiamas rezultatas.Kiekybinei analizei nenaudojant etikečių buvo naudojamas normalizuotas baltymų kiekis iš trijų biologinių pakartojimų.Baltymų tarpląstelinės lokalizacijos analizė buvo atlikta naudojant Gene Ontology (GO) analizę iš DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 ir duomenų bazes, kurias sudarė ir paskelbė Alice Ting grupė.Vulkano žemėlapis buvo gautas iš Perseus (v1.6.15.0). Baltymų gausos kartos pokyčių statistinis reikšmingumas buvo patikrintas naudojant dvipusį t testą, o baltymų atitikčiai nustatyti, kai gausos pokytis >2 (jei nenurodyta kitaip) ir p reikšmė <0,05. Baltymų gausos kartos pokyčių statistinis reikšmingumas buvo patikrintas naudojant dvipusį t testą, o baltymų atitikčiai nustatyti, kai gausos pokytis >2 (jei nenurodyta kitaip) ir p reikšmė <0,05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Baltymų kiekio kartų pokyčių statistinis reikšmingumas buvo patikrintas naudojant dviejų uodegų t testą, o baltymų atitikmenys buvo nustatyti su kiekio pokyčiu >2 (jei nenurodyta kitaip) ir ap <0,05.使用 双边 t 检验 蛋白质 丰度 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 ， 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化 变化> 2 （除非 另 有 说明） 和 p 值 <0,05。使用 双边 t 检验 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 统计 显着性 并 确定 蛋白质 中 中 的 丰度 变化 变化> 2 （另 另 说明） 和 P 值 <0,05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Baltymų kiekio pakitimų kartų statistinis reikšmingumas buvo patikrintas naudojant dviejų uodegų t testą, o baltymų atitikmenys buvo nustatyti, kai kiekio pokyčiai >2 (jei nenurodyta kitaip) ir p reikšmės <0,05.Baltymų sąveikos analizė buvo atlikta naudojant GO analizę kartu su String duomenų baze.
Buvo atlikti trys biologiniai pakartojimai su panašiais rezultatais.Statistinė analizė atlikta naudojant „GraphPad Prism“ („GraphPad“ programinė įranga), o ugnikalnių brėžiniai buvo sukurti naudojant „Perseus“ (v1.6.15.0).Norint palyginti dvi grupes, p reikšmės buvo nustatytos naudojant dviejų krypčių Studento t testą.Tik pavieniai baltymai, identifikuoti mažiausiai du kartus eksperimentinėje grupėje, buvo įtraukti į ugnikalnių diagramas, o atitinkamos trūkstamos vertės kontrolinėje grupėje buvo pakeistos Perseus iš normalaus pasiskirstymo, kad būtų galima apskaičiuoti p reikšmę.Klaidų juostos rodo vidurkį ± standartinį nuokrypį.Atliekant statistinės analizės proteominę analizę, baltymų, pasirodžiusių bent dviejuose biologiniuose pakartojimuose, gausa buvo išsaugota.Imties dydžiui iš anksto nustatyti statistiniai metodai nebuvo naudojami.Eksperimentai nėra atsitiktiniai.Eksperimento ir rezultatų vertinimo metu mokslininkai nebuvo akli užduočių atžvilgiu.
Daugiau informacijos apie studijų planavimą rasite gamtos tyrimų ataskaitos santraukoje, susietoje su šiuo straipsniu.
Šiame tyrime gauti masės spektrometrijos duomenys buvo pateikti ProteomeXchange konsorciumui per iProX57 partnerių saugyklą su duomenų rinkinio ID PXD034811 (PDPL-MS duomenų rinkinys).Neapdoroti duomenys pateikiami neapdorotų duomenų failų forma.Šiame straipsnyje pateikiami pirminiai duomenys.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Apylinkės pažinimas: nuo artumo priklausomo biotinilinimo naudojimas baltymų kompleksams charakterizuoti ir organelių žemėlapiams sudaryti. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Apylinkės pažinimas: nuo artumo priklausomo biotinilinimo naudojimas baltymų kompleksams charakterizuoti ir organelių žemėlapiams sudaryti.Gingras, AS, Abe, KT ir Raut, B. Susipažinimas su aplinka: naudojant nuo artumo priklausomą biotinilinimą baltymų kompleksams apibūdinti ir organoidams sudaryti. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Kaimynystės supratimas: pasinaudokite kaimynystės priklausomybe nuo biologinės gyvybės.Gingras, AS, Abe, KT ir Raut, B. Artumo supratimas: baltymų kompleksų apibūdinimas ir organelių kartografavimas naudojant nuo artumo priklausomą biotinilinimą.Dabartinė.Mano nuomonė.Cheminis.biologija 48, 44–54 (2019).
Geri, JB ir kt.Mikroaplinkos kartografavimas perduodant Dexterio energiją imuninėms ląstelėms.Mokslas 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL ir kt.Dviejų proteomų masto tinklai aptinka ląstelėms būdingą žmogaus sąveikos remodeliavimą.Ląstelės 184, 3022–3040.e3028 (2021).