žinios

Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com.Naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą.Norėdami gauti geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“).Tuo tarpu norėdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę pateiksime be stilių ir „JavaScript“.
Vėžio ląstelės sukūrė įvairius mechanizmus, kad įveiktų ląstelių stresą ir toliau progresuotų.Baltymų kinazė R (PKR) ir jos baltymų aktyvatorius (PACT) yra pradiniai atsakai, kurie stebi įvairius streso signalus, dėl kurių slopinamas ląstelių proliferacija ir apoptozė.Tačiau PACT-PKR kelio reguliavimas vėžio ląstelėse iš esmės nežinomas.Čia mes nustatėme, kad ilga nekoduojanti RNR (lncRNR) aspartil tRNR sintetazės antisensinė RNR 1 (DARS-AS1) yra tiesiogiai susijusi su PACT-PKR kelio slopinimu ir skatina vėžio ląstelių dauginimąsi.Naudodami didelio masto funkcinį CRISPRi 971 su vėžiu susijusios lncRNR atranką, nustatėme, kad DARS-AS1 buvo susijęs su žymiai padidėjusiu vėžio ląstelių proliferacija.Todėl DARS-AS1 išmušimas slopina ląstelių proliferaciją ir skatina vėžio ląstelių apoptozę įvairiose vėžio ląstelių linijose in vitro ir žymiai sumažina naviko augimą in vivo .Mechaniškai DARS-AS1 jungiasi tiesiogiai su PACT aktyvinimo domenu ir užkerta kelią PACT-PKR sąveikai, taip sumažindamas PKR aktyvaciją, eIF2α fosforilinimą ir slopindamas apoptotinę ląstelių mirtį.Kliniškai DARS-AS1 yra plačiai išreikštas daugybe vėžio formų, o per didelė šios lncRNR ekspresija rodo prastą prognozę.Šis tyrimas išaiškina vėžiui specifinį PACT-PKR kelio reguliavimą DARS-AS1 lncRNR ir suteikia dar vieną vėžio prognozės ir gydymo tikslą.
Gebėjimas prisitaikyti prie streso yra svarbi vėžio ląstelių išgyvenimo ir dauginimosi savybė.Greitas vėžio dauginimasis ir metaboliniai požymiai pasiekia aukščiausią tašką atšiaurioje mikroaplinkoje - maistinių medžiagų trūkumas, hipoksija ir žemas pH -, kurie gali sukelti ląstelių mirties signalizacijos kelius.Vėžiui dažnai stebimas stresui jautrių genų, tokių kaip p535, šilumos šoko baltymai 6, 7, KRAS8, 9 ir HIF-110, 11, 12, 13, reguliavimo sutrikimas, taip blokuojant apoptozę ir skatinant išgyvenimą.
Baltymų kinazė R (PKR) yra svarbus streso jutiklis ir eukariotų iniciacijos faktoriaus 2α (eIF2α) subvieneto kinazė, transliacijos reguliatorius, susiejantis ląstelių stresą su ląstelių mirtimi.Iš pradžių PKR buvo identifikuotas kaip antivirusinis baltymas, aptikus svetimą dvigrandę RNR (dsRNR).Po aktyvavimo PKR fosforilina eIF2α, kad slopintų viruso ir ląstelių baltymų sintezę 14, 15, 16.PACT (PKR aktyvatoriaus baltymas) buvo nustatytas kaip pirmasis PKR aktyvatoriaus baltymas, kai nėra dsRNR17, 18, 19, 20, 21, 22, 23.Tiesiogiai sąveikaudamas su PKR, PACT perduoda įvairius įtempius (serumo badą, apdorojimą peroksidu ar arsenitu) į PKR ir pasroviui esančius signalizacijos kelius.Be eIF2α fosforilinimo, PACT sukeltas PKR aktyvinimas sukelia įvairius įvykius, susijusius su atsaku į stresą, įskaitant pakitusią redokso būseną per PI3K / Akt24 kelią, sustiprintą DNR pažeidimo patikrinimą per p5325, 26 ir NF-κB27, 28 Reguliuoja transkripciją, 29. Atsižvelgiant į jų lemiamą vaidmenį reaguojant į stresą, proliferaciją, apoptozę ir kitus pagrindinius ląstelių procesus, PKR ir PACT yra perspektyvūs daugelio ligų, ypač vėžio, terapiniai taikiniai30, 31, 32, 33.Tačiau, nepaisant šios pleiotropinės funkcinės ir biologinės reikšmės, PACT / PKR aktyvumo reguliavimas vėžio ląstelėse išlieka sunkus.
LncRNR yra didesni nei 200 nukleotidų transkriptai, neturintys baltymų kodavimo potencialo.Kadangi pažangiausi viso genomo sekos nustatymo projektai nustatė tūkstančius lncRNR, 35, 36 buvo dedama daug pastangų siekiant išsiaiškinti jų biologines funkcijas.Vis daugiau tyrimų parodė, kad lncRNR dalyvauja daugelyje biologinių procesų37, įskaitant X-chromosomų inaktyvacijos reguliavimą38,39, įspaudimą40, transkripciją41,42, transliaciją43 ir net vėžio augimą44,45,46,47.Šie tyrimai parodė, kad daugelis lncRNR dalyvauja PACT / PKR kelyje.Vienas iš tokių tyrimų parodė, kad lncRNA ASPACT slopino PACT transkripciją ir padidino PACT mRNR branduolinį sulaikymą.Kiti tyrimai parodė, kad lncRNR nc886 jungiasi prie PKR ir slopina jo fosforilinimą49,50.Iki šiol nebuvo pranešta apie lncRNR, reguliuojančią PACT sukeltą PKR aktyvavimą.
Nustatyta, kad aspartil-tRNR sintetazės antisensinė RNR 1 (DARS-AS1) yra onkogeninė lncRNR51, 52, 53, 54.Įrodyta, kad reguliuojant miP-194-5p53, miP-12952 ir miP-532-3p51, DARS-AS1 skatina atitinkamai skaidrių ląstelių inkstų ląstelių karcinomos, skydliaukės karcinomos ir nesmulkialąstelinės plaučių karcinomos augimą.Tongas ir jo kolegos taip pat nustatė, kad DARS-AS1 skatina mielomos progresavimą išlaikant baltymo 39 (RBM39) RNR surišimo motyvo stabilumą.Tačiau nebuvo atlikta jokių tyrimų, ar ši lncRNR yra susijusi su PACT-PKR aktyvacijos ir vėžio ląstelių atsako į stresą reguliavimu.
Čia atlikome didelio masto funkcijų praradimo ekraną naudodami CRISPRi sistemą ir nustatėme, kad DARS-AS1 lncRNR skatina kelių tipų vėžio ląstelių dauginimąsi.Be to, mes nustatėme pagrindinį mechanizmą: DARS-AS1 tiesiogiai jungiasi prie PACT, slopina PACT ir PKR prisijungimą, neleidžia fosforilinti eIF2α, žemesnio PKR substrato, ir galiausiai slopina apoptotinę ląstelių mirtį.Apibendrinant, mūsų darbas atskleidžia DARS-AS1 lncRNR kaip PACT-PKR kelio reguliatorių ir galimą vėžio gydymo ir prognozės tikslą.
Išsamūs genomo profiliavimo tyrimai nustatė šimtus lncRNR, susijusių su vėžiu.Tačiau jų funkcija iš esmės nežinoma56.Norėdami nustatyti perspektyvius lncRNR kandidatus, susijusius su vėžio progresavimu, atlikome funkcijos praradimo ekraną, kad sumažintume SW620 gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio ląstelių liniją, naudodami CRISPRi sistemą (1a pav.).Unikali SW480 ir SW620 gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linijų savybė yra ta, kad jos gaunamos iš vieno paciento pirminių ir antrinių navikų.Tai yra vertingas palyginimas tiriant pažengusio gaubtinės žarnos vėžio progresavimo genetinius pokyčius.Todėl mes išanalizavome gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio ląstelių linijų (SW480 ir SW620) transkriptus, naudodami RNR sekos nustatymą, ir surinkome keletą galimų funkcinių lncRNR iš paskelbtos literatūros.Remdamiesi šiais rezultatais, mes sukūrėme sujungtą sgRNR biblioteką, kurioje yra 7355 sgRNR oligos, nukreiptos į 971 su vėžiu susijusią lncRNR ir 500 netikslinių sgRNR oligų neigiamai kontrolei (1 papildomi duomenys).
Scheminis atrankos vaizdavimas naudojant CRISPRi sistemą.b sgRNR praturtinimas po atrankos.Horizontali punktyrinė linija reiškia log2 (kartų pokytis) = ±0,58.Vertikali punktyrinė linija rodo p reikšmę = 0,05.Juodi taškai žymi netikslinę sgRNR (pažymėtą kaip NC).Raudoni taškai yra sgRNR, nukreiptos į DARS-AS1.Mėlyni taškai yra sgRNR, nukreiptos į LINC00205, anksčiau aprašytą onkogeninę lncRNR.kartos pokytis = (normalizuotas rodmuo, 17 diena)/(normalizuotas rodmuo, 0 diena).c DARS-AS1 sgRNR numušimas slopino ląstelių augimą.Klaidų juostos rodo ± standartinį trijų eksperimentų nuokrypį.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 dvipusis Stjudento t testas.d DARS-AS1 ekspresija navikuose (TCGA duomenų rinkinys).em DARS-AS1 ekspresija suporuotuose normaliuose ir naviko mėginiuose iš pacientų, sergančių atitinkamai BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP ir COAD (TCGA duomenų rinkinys).p vertės buvo gautos naudojant suporuotą dviejų uodegų Studento t testą.
Sukūrę plazmidę ir supakavę lentivirusą, keturiuose nepriklausomuose infekcijos eksperimentuose transdukavome dCas9-SW620 gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio ląstelių liniją su aukščiau pateikta biblioteka.Šių infekcijų infekcijos dažnis (MOI) buvo 0, 1–0, 3, o tai rodo, kad kiekviena ląstelė gali būti transfekuota tik viena sgRNR.Po 18 dienų in vitro kultivavimo, tikslinių sgRNR praturtinimo profilis sumažėjo arba padidėjo po atrankos, o netikslinių kontrolinių oligonukleotidų skaičius išliko santykinai nepakitęs, palyginti su išankstinio atrankos profiliu, o tai rodo, kad mūsų taikinys turi labai specifinį ekraną. biblioteka.Ryžiai.1b ir 1 papildoma lentelė). LINC00205, kuris anksčiau buvo pranešta, kad skatina plaučių vėžį ir kepenų vėžio progresavimą58, 59, 60, buvo ištirtas (log2 (kartų pokytis) < –0,58, p reikšmė < 0,05), patvirtinantis šios patikros patikimumą (1b pav.). LINC00205, kuris anksčiau buvo pranešta, kad skatina plaučių vėžį ir kepenų vėžio progresavimą58, 59, 60, buvo ištirtas (log2 (kartų pokytis) < –0,58, p reikšmė < 0,05), patvirtinantis šios patikros patikimumą (1b pav.). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, apie kurį anksčiau buvo pranešta, kad jis skatina plaučių vėžio ir kepenų vėžio progresavimą58, 59, 60, buvo atmestas (log2 (karto pokytis) <-0,58, p-reikšmė <0,05), patvirtinanti šios patikros patikimumą (.1b pav.) . Linc00205 之前 被 报道 可 促进 和 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （log2 （倍数 变化） <-0,58 ， p 值 <0,05） ， 证实 该 筛选 的 可靠性 （（（图 图）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 （可靠性 可靠性 （（图 1b）。。。。。 可靠性 可靠性 可靠性 （（图 1b。。 Linc00205 之前 被 报道 可 促进 和 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （log2 （倍数 变化） <-0,58 ， p 值 <0,05） ， 证实 该 筛选 的 可靠性 （（（图 图）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 （可靠性 可靠性 （（图 1b）。。。。。 可靠性 可靠性 可靠性 （（图 1b。。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, apie kurį anksčiau buvo pranešta, kad jis skatina plaučių ir kepenų vėžio progresavimą58, 59, 60, buvo atmestas (log2 (pokytis karto) <-0,58, p-reikšmė <0,05, o tai patvirtina šios patikros patikimumą (.1b pav.).
Tarp visų tirtų lncRNR taip pat buvo patikrintas DARS-AS1, o trys giminingi sgRNR oligonukleotidai po 18 dienų auginimo žymiai sumažėjo, o tai rodo, kad šios lncRNR numušimas sumažino vėžio proliferaciją (1b pav.).Šį rezultatą dar labiau patvirtino gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio ląstelių MTS analizė, rodanti, kad DARS-AS1 numuštų ląstelių augimo greitis buvo tik perpus mažesnis, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis (1c pav.), Ir atitiko ankstesnius pranešimus apie keletą kitų vėžio tipų.: skaidrių ląstelių inkstų vėžys, skydliaukės vėžys ir nesmulkialąstelinis plaučių vėžys51,52,53,55.Tačiau jo funkcija ir molekuliniai mechanizmai sergant gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžiu lieka neištirti.Todėl tolesniam tyrimui pasirinkome šią lncRNR.
Norėdami ištirti DARS-AS1 ekspresiją pacientams, mes išsamiai išanalizavome 10 327 naviko mėginius iš vėžio genomo atlaso (TCGA) projekto.Mūsų rezultatai rodo, kad DARS-AS1 yra plačiai ekspresuojamas ir žymiai padidintas sveikose ląstelėse įvairiuose navikuose, įskaitant gaubtinės žarnos adenokarcinomą (COAD), inkstų skaidrių ląstelių karcinomą (KIRC) ir inkstų papiliarinių ląstelių karcinomą (KIRP)..Labai nedaug (1d pav. ir papildomas 1a, b pav.). Suporuotų sveikų / naviko mėginių analizė dar labiau patvirtino žymiai didesnę DARS-AS1 ekspresiją šlapimo pūslės urotelinės karcinomos (BLCA), inkstų inkstų skaidriųjų ląstelių karcinomos (KIRC), prostatos adenokarcinomos (PRAD), plaučių plokščiųjų ląstelių karcinomos (LUSC) navikuose. , gimdos korpuso endometriumo karcinoma (UCEC), plaučių adenokarcinoma (LUAD), kepenų hepatoceliulinė karcinoma (LIHC), inkstų inkstų papiliarinių ląstelių karcinoma (KIRP) ir storosios žarnos adenokarcinoma (COAD) (p vertė < 0,05) (1e–m pav.) . Suporuotų sveikų / naviko mėginių analizė dar labiau patvirtino žymiai didesnę DARS-AS1 ekspresiją šlapimo pūslės urotelinės karcinomos (BLCA), inkstų inkstų skaidriųjų ląstelių karcinomos (KIRC), prostatos adenokarcinomos (PRAD), plaučių plokščiųjų ląstelių karcinomos (LUSC) navikuose. , gimdos korpuso endometriumo karcinoma (UCEC), plaučių adenokarcinoma (LUAD), kepenų hepatoceliulinė karcinoma (LIHC), inkstų inkstų papiliarinių ląstelių karcinoma (KIRP) ir storosios žarnos adenokarcinoma (COAD) (p vertė < 0,05) (1e–m pav.) .Suporuotų sveikų / naviko mėginių analizė taip pat patvirtino žymiai didesnę DARS-AS1 ekspresiją sergant šlapimo pūslės urotelio karcinoma (BLCA), skaidrių ląstelių inkstų ir inkstų ląstelių karcinoma (KIRC), prostatos adenokarcinoma (PRAD), plaučių plokščiųjų ląstelių karcinoma (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , gimdos kūno endometriumo karcinoma (UCEC), plaučių adenokarcinoma (LUAD), hepatoceliulinė kepenų karcinoma (LIHC), inkstų papiliarinė ląstelių karcinoma (KIRP) ir gaubtinės žarnos adenokarcinoma (COAD) (p vertė < 0,05) (1e pav.– m) .配对健康/肿瘤样本的分析进一步证实了DARS-AS1 在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、肾肾透明细胞癌(KIRC)、前列腺腺癌(PRAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC) 肿瘤中的显着 更 表达 ， 子宫体子宫 子宫体子宫 癌 （（UCEC） ， 肺腺癌 （（Luad） ， 肝肝 细胞癌 （（lihc） ， 肾 肾 乳头状 细胞癌 （Kirp） 和结肠腺癌 （coad） （（p 值<0,05）(图1e-m）).配对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌)癌 （kirp） （coad） （p 值<0,05）（图1e-m） .Sveikų / navikų suporuotų mėginių analizė dar labiau patvirtino DARS-AS1 vaidmenį šlapimo pūslės urotelinės karcinomos (BLCA), skaidrių ląstelių inkstų ląstelių karcinomos (KIRC), prostatos adenokarcinomos (PRAD) ir plaučių plokščiųjų ląstelių karcinomos (LUSC) navikuose.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). ekspresija sergant korpuso gimdos karcinoma (UCEC), plaučių adenokarcinoma (LUAD), kepenų ląstelių karcinoma (LIHC), inkstų papiliarinių ląstelių karcinoma (KIRP) ir gaubtinės žarnos adenokarcinoma (COAD) (p vertė <0,05) (1e -m pav.).Apibendrinant, šie rezultatai rodo, kad DARS-AS1 yra plačiai ir labai išreikštas įvairiose vėžio formose.
Kadangi DARS-AS1 ir DARS (genas, koduojantis antisensinę grandinę) turi tą patį promotorių ir yra vienas šalia kito, mes sukūrėme shRNR taip, kad specialiai numuštų DARS-AS1, bet ne DARS (papildomas 2a, b pav. ir 2 papildoma lentelė). .Be SW620, mes taip pat panaudojome tris kitas ląstelių linijas, labai ekspresuojančias DARS-AS1, kad ištirtume shRNR numušimo veiksmingumą ir funkciją (3 papildoma lentelė).Mūsų rezultatai parodė, kad visos trys sukurtos shRNR pasiekė mažiausiai 80% DARS-AS1 numušimo efektyvumą, o DARS mRNR kiekiui įtakos neturėjo (papildomas 2c–f pav.).Be to, mes nustatėme, kad DARS-AS1 numušimas su šiomis shRNR reikšmingai slopino ląstelių augimą gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio ląstelių linijose SW620 (49,7%) ir HCT116 (27,7%), krūties vėžio ląstelių linijoje MBA-MD-231 (53,4%).) ir HepG2 hepatomos ląstelių linija (sumažėjimas 92,7 %), taip pat jų gebėjimas formuoti neįtvirtintas sferas (vienoje ląstelių linijoje vidutiniškai sumažėja ~50,8%, 44,6%, 40,7% ir 75,7%) (2a, b pav.).SW620 kolonijų susidarymo tyrimo rezultatai dar labiau patvirtino, kad DARS-AS1 shRNR reikšmingai slopino ląstelių dauginimąsi, vidutiniškai sumažindama maždaug 69,6 % (2c pav.).
Kontrolinės shRNR ir DARS-AS1 shRNR poveikis ląstelių proliferacijai (a) ir sferoidų susidarymui (b) SW620, HCT116, MBA-MD-231 ir HepG2 ląstelėse.c Kontrolinės shRNR ir DARS-AS1 shRNR poveikis kolonijų susidarymui SW620 ląstelėse.SW620 ląstelių, per daug ekspresuojančių DARS-AS1, ląstelių proliferacija (d), sferoidų susidarymas (e) ir kolonijų susidarymas (f).Rodomi duomenys yra trijų eksperimentų vidurkis ± standartinis nuokrypis.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 ir *** p ≤ 0,001 pagal dvipusį Stjudento t testą.
Norėdami papildyti funkcijos praradimo tyrimus, mes sukūrėme SW620 ląsteles, kurios per daug ekspresuoja DARS-AS1 (papildomas 2g pav.).Per didelis DARS-AS1 ekspresija SW620 ląstelėse žymiai padidino ląstelių augimą (1,8 karto), nesurištų sferoidų susidarymą (1,4 karto) ir kolonijų susidarymą (3,3 karto) (2d – f pav.).Šį rezultatą patvirtinome naudodami kitą DARS-AS1 ekspresuojančią ląstelių liniją A549.Šis padidėjęs ląstelių proliferacija dėl DARS-AS1 per didelės ekspresijos buvo toliau stebimas A549 ląstelėse (papildomas 2h pav., i ir 3 papildoma lentelė).Kartu šie pelno ir nuostolių tyrimai rodo, kad DARS-AS1 skatina vėžio ląstelių dauginimąsi in vitro .
Norėdami ištirti pagrindinį mechanizmą, kuriuo DARS-AS1 reguliuoja ląstelių proliferaciją, atlikome RNR išskleidžiamąją analizę, kad nustatytų galimus baltymus surišančius partnerius.RT-qPCR rezultatai parodė, kad apie 86,2% DARS-AS1 yra SW620 ląstelių citoplazmoje (papildomas 3a pav.).Tada in vitro transkribuotas biotinilintas DARS-AS1 arba pseudoRNR buvo inkubuojamas su SW620 ląstelių lizatais, po to atskirtas SDS-PAGE.Vėlesnis dažymas sidabru parodė, kad atskira juosta (~ 38 kDa) buvo žymiai praturtinta DARS-AS1 traukimo mėginiuose, bet ne fiktyviuose RNR ar granulių mėginiuose (3a pav.).Ši juosta buvo identifikuota kaip PKR aktyvuojantis baltymas (PACT) masių spektrometrijos metodu (MS) ir toliau patvirtinta imunoblotingu SW620, HCT116 ir HepG2 ląstelių linijose (3a, b pav.).DARS ir susijusių PACT baltymų – PKR ir TRBP – praturtėjimas taip pat buvo tiriamas naudojant RNR analizę Western blot (WB) metodu.Rezultatai parodė, kad tiesioginės sąveikos tarp DARS-AS1 RNR ir šių trijų baltymų nerasta (papildomas 3b pav.).Specifinę DARS-AS1 ir PACT sąveiką patvirtino RNR imunoprecipitacijos (RIP) analizė, kuri parodė, kad DARS-AS1 buvo žymiai praturtintas anti-PACT antikūnais, bet ne kitomis kontrolinėmis RNR (3c pav.).Norint nustatyti, ar DARS-AS1 tiesiogiai sąveikauja su PACT, nesant kitų ląstelių komponentų, buvo atliktas in vitro biologinio sluoksnio interferometrijos (BLI) tyrimas naudojant išgrynintą PACT.Biotinu pažymėta DARS-AS1 arba netikra RNR buvo imobilizuota ant streptavidino (SA) biosensorių ir inkubuojama kinetiniame buferyje, kuriame yra 1 μM PACT.Pažymėtina, kad PACT stipriai prisijungė prie DARS-AS1 (KD vertė ~ 26, 9 nM), bet ne imituoti RNR (3d pav.).Visi šie rezultatai rodo tiesioginę sąveiką ir didelį afinitetą tarp DARS-AS1 ir PACT.
RNR traukos analizė nustatė DARS-AS1, sąveikaujantį su PACT SW620 ląstelėse.Aukščiau, susijusių baltymų dažymas sidabru.Apatiniai imunoblotai buvo atlikti naudojant anti-PACT antikūnus.b RNR išskleidžiamoji analizė buvo atlikta HCT116 (viršuje) ir HepG2 (apačioje) ląstelėse.PACT sodrinimas buvo aptiktas imunoblotingu.cRNR imunoprecipitacijos (RIP) tyrimai buvo atlikti SW620 ląstelėse, naudojant nurodytus antikūnus.d PACT prisijungimo prie viso ilgio DARS-AS1 arba kontrolinės RNR kreivės buvo gautos naudojant biologinio sluoksnio interferometriją (BLI).RNR buvo imobilizuota ant streptavidino biojutiklio.Asociacijai matuoti buvo naudojamas 1 μM PACT.e RNR traukimo tyrimas buvo atliktas naudojant biotiniluotą viso ilgio DARS-AS1 arba sutrumpintą (viršuje).Imunoblotas, rodantis gautą PACT (apačioje).f Išgrynintas pažymėtas PACT buvo inkubuojamas su biotiniluotu viso ilgio DARS-AS1 arba sutrumpintas (kaip e) in vitro RIP tyrimui.Išskirta RNR buvo patikrinta RT-qPCR.g Santykinis skirtingų RNR fragmentų afinitetas PACT buvo gautas naudojant biologinio sluoksnio interferometriją.Analizei buvo naudojama 100 nM RNR ir 1 μM RAST.h In vitro RIP tyrimai buvo atlikti naudojant išgrynintą nepažeistą arba sutrumpintą pažymėtą PACT.Išskirta RNR buvo patikrinta RT-qPCR.i SW620 ląstelių, per daug ekspresuojančių DARS-AS1, PACT arba abu, augimo greitis.j Per didelis viso ilgio arba sutrumpinto DARS-AS1 ekspresija SW620 ląstelėse turėjo skirtingą poveikį ląstelių augimui.k Apoptozė buvo aptikta imunoblotuojant anti-PARP antikūnu.l DARS-AS1 išmušimas sukelia SW620 ląstelių apoptozę, kaip parodyta srauto citometrija.Rodomi duomenys yra trijų eksperimentų vidurkis ± standartinis nuokrypis. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, pagal dvipusį Stjudento t testą. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, pagal dvipusį Stjudento t testą. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 pagal dvipusį Stjudento t testą. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 pagal dvipusį Stjudento t testą.
Tada mes sukūrėme tris biotiniluotus DARS-AS1 RNR fragmentus in vitro transkripcijos būdu, kad nustatytume DARS-AS1 regioną, reikalingą PACT asociacijai (3e pav.).RNR analizės rezultatai parodė, kad kiekvienas fragmentas galėjo sąveikauti su PACT, tačiau 3′-galinėje srityje (384–768 nukleotidai, pažymėti A3) buvo daugiau nei 1–384 nukleotidai, pažymėti A1) (3e pav.).Panašūs rezultatai buvo pastebėti atliekant in vitro RIP tyrimą, naudojant rekombinantinį PACT (3f pav.).Remiantis šiais rezultatais, eksperimentai, skirti prijungti imobilizuotus RNR fragmentus prie PACT naudojant BLI, taip pat parodė, kad PACT turi didesnį afinitetą A3 (384–768 nt) (KD vertė yra maždaug 94, 6 nM), o sąsajų su kitomis sritimis beveik nėra.(3d pav.).
Mes taip pat ištyrėme susijusius surišimo regionus PACT.PACT yra trys funkciniai domenai, iš kurių du yra konservuoti dvigrandžiai RNR surišantys domenai (dsRBD) ir trečiasis domenas (pažymėtas D3), kuris veikia kaip baltymų sąveikos aktyvatorius.Norėdami ištirti kiekvieno domeno lncRNR surišimo pajėgumą, sukūrėme tris mutacijas, kurios pašalino kiekvieną iš trijų domenų ir atlikome in vitro RIP tyrimą.Mūsų rezultatai parodė, kad PACT trečiojo domeno (D3) ištrynimas reikšmingai sumažino jo sąveiką su DARS-AS1 (0,11 karto, palyginti su nepažeistu PACT), palyginti su kitomis dviem mutacijomis (3h pav.), buvo parodyta, kad išsiskyrimas. D3 sąveikavo su DARS.-AC1.Visi šie rezultatai rodo, kad sąveika tarp DARS-AS1 ir PACT gali vykti pirmiausia per DARS-AS1 3′ galą ir PACT D3 domeną.
Pastebėjome, kad DARS-AS1 neturėjo įtakos PACT ekspresijai, o PACT neturėjo įtakos DARS-AS1 (papildomas 3c pav.).Tada ištyrėme PACT numušimo poveikį ląstelių augimui.Priešingai nei DARS-AS1, santykinės ląstelės augo 1,5–3 kartus greičiau, kai PACT buvo numuštas (papildomas 3d pav.).Kolonijų susidarymo tyrimo rezultatai parodė, kad po shRNR apdorojimo PACT ląstelės sudarė 2–3 kartus didesnes kolonijas (papildomas 3e pav.).Norėdami patikrinti, ar DARS-AS1 reguliuoja ląstelių proliferaciją per PACT, sukūrėme SW620 ląsteles, kurios per daug ekspresuoja PACT, DARS-AS1 arba abu.Per didelė PACT ekspresija parodė reikšmingą ląstelių proliferacijos slopinimą (3i pav.).Nors per se DARS-AS1 ekspresija reikšmingai skatino ląstelių proliferaciją, DARS-AS1 ir PACT per daug ekspresuojančių ląstelių augimo greitis reikšmingo skirtumo nebuvo.Šie rezultatai rodo, kad PACT gali neutralizuoti padidėjusį proliferaciją, kurią sukelia DARS-AS1 per didelė ekspresija.
Kadangi skirtingi DARS-AS1 regionai turi skirtingus PACT surišimo gebėjimus, mes ištyrėme jų santykinę įtaką ląstelių proliferacijai dėl skirtingos DARS-AS1 fragmentų ekspresijos.Palyginti su kitais dviem fragmentais, DARS-AS1 buvo per daug išreikštas 3′ gale (384–768 nt), pagrindiniame su PACT susijusiame DARS-AS1 regione, kuris turėjo didžiausią gebėjimą skatinti ląstelių proliferaciją (3j pav.).Šie rezultatai rodo teigiamą koreliaciją tarp DARS-AS1 surišimo pajėgumo ir biologinės funkcijos.
Buvo pranešta, kad PACT yra proapoptozinis baltymas19.Todėl mes ištyrėme DARS-AS1 poveikį apoptozei.Kaip ir tikėtasi, DARS-AS1 numušimas žymiai padidino PARP skilimą SW620 ląstelėse ir padidino aneksino V teigiamų ląstelių dalį SW620, HCT116, HepG2 ir MBA-MD-231 ląstelių linijose (3k pav.).3).3f – h), nurodant, kad anti-apoptotinis DARS-AS1 poveikis vėžio ląstelėse yra priešingas PACT apoptozę sukeliančiai funkcijai.Visi šie rezultatai rodo, kad DARS-AS1 onkogeninės funkcijos mechanizmas gali būti PACT funkcijos slopinimas.
Toliau mes ištyrėme funkcines DARS-AS1-PACT asociacijos pasekmes.Buvo pranešta, kad PACT aktyvuoja PKR per tiesioginę sąveiką, o tai vėliau sustiprina eIF2α fosforilinimą, sukeldama transliacijos deleciją ir apoptozę17.Pirmiausia ištyrėme, ar DARS-AS1 veikia PACT ir PKR ląstelių lokalizaciją.Konfokalinė fluorescencinė mikroskopija parodė, kad PACT ir PKR buvo labai kolokalizuoti SW620 ląstelėse, o vidutinis Pearsono koreliacijos koeficientas buvo 0, 72.Tuo tarpu DARS-AS1 ekspresija reikšmingai sumažino PACT ir PKR kolokalizaciją (vidutinis Pearsono koreliacijos koeficientas 0,61) (4a pav.).Norėdami ištirti, ar DARS-AS1 gali moduliuoti PACT-PKR sąveiką, atlikome bendro imunoprecipitacijos (co-IP) tyrimą su anti-PACT antikūnu SW620 ląstelių lizatuose.PKR buvo labai praturtintas anti-PACT kontrolinėse ląstelėse, o PKR kiekis buvo žymiai sumažintas lizatuose iš ląstelių, kurios per daug ekspresuoja DARS-AS1 (4b pav.).In vitro baltymų surišimo tyrimams buvo naudojami išgryninti pažymėti PACT ir PKR.Atitinkamai, tie, kurie pateikė DARS-AS1, bet neturėjo kontrolinės RNR, parodė slopintą PACT-PKR sąveiką (4c pav.).Visi rezultatai parodė, kad DARS-AS1 sutrikdė PACT ir PKR ryšį.
Naudojant konfokalinę fluorescencinę mikroskopiją, buvo pastebėtas PACT ir PKR lokalizavimas kontrolinėse ląstelėse arba ląstelėse, kurios per daug ekspresuoja DARS-AS1.Branduoliai buvo nudažyti DAPI.Statistiniai rezultatai gauti iš 16 nuotraukų.b Bendras imunoprecipitavimas (co-IP), naudojant anti-PACT antikūnus kontrolinių SW620 ląstelių arba ląstelių, kurios per daug ekspresuoja DARS-AS1, lizatuose.c Paženklintas PACT, išgrynintas PKR ir transkribuotas in vitro su DARS-AS1 arba imitacine RNR, buvo inkubuojamas in vitro baltymų surišimo analizei.Imunoprecipitacijai buvo naudojami antikūnai prieš vėliavą.d Imunoblotai su nurodytais antikūnais buvo atlikti SW620 ir HCT116 ląstelėse, transfekuotose kontroline shRNR arba DARS-AS1-shRNR, o po to serumo badu.DARS-AS1 ekspresijos lygiai pakeitė ląstelių jautrumą thapsigarginui.SW620 ląstelės buvo transfekuotos DARS-AS1 shRNR, DARS-AS1 ekspresijos plazmide arba kontroline plazmide.Ląstelės buvo apdorotos thapsigargin 48 valandas, o ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas naudojant MTS reagentą.f In vitro transkribuota DARS-AS1 arba fiktyvi RNR ir išgrynintas PACT buvo naudojami in vitro aktyvinimo tyrimui ir imunoblotų aptikimui.g Imunoblotai, naudojant šiuos antikūnus, buvo atlikti su SW620-ctrl ląstelėmis (kairėje) arba ląstelėmis, kurios per daug ekspresuoja PKR mutantus (dešinėje).Tada šios ląstelės buvo transfekuotos kontroline shRNR arba DARS-AS1-shRNR, po to badavo serumą.h Srauto citometrija parodė, kad mutanto PKR inaktyvacija kompensavo DARS-AS1 sukeltą apoptozę SW620 ląstelėse.i Imunoblotai su nurodytais antikūnais buvo atlikti SW620 (kairėje) arba HCT116 (dešinėje) ląstelėse.Ląstelės, transfekuotos kontroline shRNR arba DARS-AS1 shRNR, yra be serumo ir papildytos 100 nM PKR C16 inhibitoriumi arba DMSO.Mastelio juosta = 5 µm.Rodomi duomenys yra trijų eksperimentų vidurkis ± standartinis nuokrypis.* p ≤ 0,05 dvipusis Stjudento t testas.
Paprastai manoma, kad kai PACT sąveikauja su PKR17, gali būti sukeltas PKR fosforilinimas ties Thr451.Mūsų rezultatai parodė, kad po serumo bado DARS-AS1 numuštose ląstelėse PKR fosforilinimo lygis buvo žymiai padidėjęs (4d pav. ir papildomas 4a pav.).Atitinkamai, mes nustatėme, kad DARS-AS1 shRNR taip pat žymiai padidino eIF2α, pagrindinio PKR substrato, fosforilinimą (4d pav. ir papildomas 4a pav.).Thapsigarginas yra ER stresorius, dėl kurio ER išskiria Ca2+.Buvo pranešta, kad gydymas tapsigarginu sukelia PACT ekspresiją ir aktyvavimą, kuris toliau sąveikauja su PKR ir aktyvuoja PKR, todėl padidėja eIF2α fosforilinimas 18, 61 .Čia mes panaudojome thapsigarginą kaip PACT / PKR kelio stimuliatorių, kad ištirtume, ar DARS-AS1 gali padėti ląstelėms įveikti stresą, slopindamas PACT / PKR kelią.Pastebėjome, kad DARS-AS1 ekspresijos lygis teigiamai koreliavo su ląstelių atsparumu thapsigarginui.SW620 ląstelės, per daug ekspresuojančios DARS-AS1, išgyveno geriau, kai buvo gydomos tapsigarginu, o ląstelės su DARS-AS1 numušimu tapo jautresnės (4e pav.).Remiantis šiais rezultatais, DARS-AS1 per didelė ekspresija sumažino tapsigargino sukeltą PKR fosforilinimą (papildomas 4b pav.).Priešingai, po gydymo tapsigarginu, PKR ir eIF2α buvo labiau fosforilinti DARS-AS1 numušimo ląstelėse, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis (papildomas 4b pav.).Įdomu tai, kad tapsigarginas sukėlė DARS-AS1 ekspresiją priklausomai nuo dozės, o tai gali rodyti DARS-AS1 antistresinę funkciją (papildomas 4c pav.).Be to, norėdami patvirtinti šiuos stebėjimus, atlikome in vitro aktyvinimo tyrimus.Trumpai tariant, PKR buvo išgrynintas iš ląstelių lizatų, naudojant anti-PKR antikūną, po to inkubuojamas su rekombinantiniu PACT ir DARS-AS1, transkribuotu in vitro.Po fermentinės reakcijos fosfo-PKR buvo aptiktas naudojant WB.Mūsų rezultatai parodė, kad PKR fosforilinimą reikšmingai slopino DARS-AS1, bet ne kontrolinė RNR (4f pav.).Šie in vitro ir in vivo rezultatai rodo, kad DARS-AS1 slopina PACT sukeltą PKR aktyvaciją.Tuo pačiu metu mes taip pat stebėjome PACT atkūrimo sumažėjimą, kai yra DARS-AS1 (4f pav.).Šis rezultatas atitinka in vitro baltymų surišimo tyrimo rezultatus (4c pav.) ir dar kartą iliustruoja DARS-AS1 blokavimo funkciją PACT-PKR asociacijai.
Ser246 ir Ser287 PACT D3 domene reikalingi PKR aktyvavimui esant ląstelių stresui.Dviejų serino liekanų pakeitimas alaninu davė mutantą PACT (mutD), kuris aktyvavo PKR nesant streso, o alanino pakeitimas (mutA) pakeitė protokolą.Kadangi įrodėme šio domeno svarbą tiesiogiai susiejant su DARS-AS1, sukūrėme šiuos du PACT mutantus, kad patikrintume, ar šios liekanos taip pat gali būti susijusios su sąveika su DARS-AS1.Įdomu tai, kad abu mutantai prarado gebėjimą prisijungti prie DARS-AS1 (papildomas 4d pav.), o tai rodo, kad norint veiksmingai sąveikauti su DARS-AS1, gali prireikti visos PACT baltymo struktūros.
Be to, mūsų rezultatai taip pat rodo, kad DARS-AS1-shRNR sukeltas ląstelių proliferacijos slopinimas gali būti iš dalies atstatytas per daug ekspresuojant dominuojantį neigiamą PACT mutantą (PACTmutA) arba dominuojantį neigiamą PKR mutantą (PKRmut) (papildomas 4e. e pav.).Per didelė dominuojančių neigiamų PKR mutantų ekspresija sumažino PKR fosforilinimą, sukeltą DARS-AS1 numušimo, taip pat eIF2α fosforilinimą ląstelėse, kuriose nėra serumo (4g pav.).Dar svarbiau, kad DARS-AS1 numušimo sukeltų apoptozinių ląstelių dalis taip pat sumažėjo ląstelėse, kurios per daug ekspresuoja PKRmut (4h pav. ir papildomas 4g pav.).PKR kinazės aktyvumo slopinimas taip pat pablogina DARS-AS1 funkciją, nes rezultatai parodė, kad DARS-AS1 numušimas retai suaktyvino PKR ir eIF2α fosforilinimą, kai ląstelės buvo gydomos PKR specifiniu C16 inhibitoriumi (4i pav. ir papildomas 4h pav.).).Apibendrinant, mūsų rezultatai rodo, kad DARS-AS1 skatina ląstelių dauginimąsi, bent iš dalies, slopindamas PACT sukeltą PKR aktyvaciją.
Norėdami toliau ištirti DARS-AS1 vaidmenį navikogenezėje, atlikome in vivo eksperimentus naudodami pelės ksenografo modelį. Rezultatai rodo, kad DARS-AS1 numušimas dramatiškai sumažino pelių naviko augimą (p vertė < 0,0001) (5a pav.). Rezultatai rodo, kad DARS-AS1 numušimas dramatiškai sumažino pelių naviko augimą (p vertė < 0,0001) (5a pav.). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а). Rezultatai rodo, kad DARS-AS1 numušimas drastiškai sumažina naviko augimą pelėse (p vertė < 0,0001) (5a pav.).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001）（囀5a（结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0,0001）（图5a） Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (рис.). Rezultatai parodė, kad DARS-AS1 numušimas žymiai sumažino naviko augimą pelėms (p vertė < 0,0001) (5a pav.).Taigi, DARS-AS1 numušimo grupėje vidutinis naviko tūris sumažėjo maždaug 72, 9%, o vidutinė naviko masė - maždaug 87, 8% (5b-d pav.).Šie rezultatai tvirtai rodo, kad DARS-AS1 gali žymiai skatinti naviko augimą in vivo .
Skelbimo DARS-AS1 numušimo poveikis nuogų pelių gaubtinės ir tiesiosios žarnos onkogenezei.Rodomos augimo kreivės (a), naviko dydis (b), svoris (c) ir naviko vaizdai (d).Klaidų juostos žymi ± SEM. n = 10. ****p < 0,0001, pagal dvipusį Stjudento t testą. n = 10. ****p < 0,0001, pagal dvipusį Stjudento t testą. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 dvipusis Stjudento t testas.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验. ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 dvipusis Stjudento t testas.e Kaplan-Meier išanalizavo ryšį tarp DARS-AS1 ekspresijos lygių ir bendro išgyvenamumo pacientams, sergantiems UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM ir LGG.Didelis DARS-AS1 ekspresijos lygis pacientams buvo 50% geriausių;žemas DARS-AS1 ekspresijos lygis pacientams buvo apatiniame 50 proc.p vertės buvo nustatytos naudojant log rango testą.f Siūlomas modelis, kuriame DARS-AS1 reguliuoja PACT-PKR kelią ir naviko augimą.
Norėdami geriau suprasti klinikinį DARS-AS1 poveikį, ištyrėme ryšį tarp jo išraiškos ir paciento išgyvenimo.Analizuodami TCGA duomenų rinkinį, nustatėme, kad didesnė DARS-AS1 ekspresija buvo susijusi su uveal melanoma (UVM), inkstų chromofobija (KICH), inkstų papiliarinių ląstelių karcinoma (KIRP), mezotelioma (MESO), multipleksu.Mažesnis išgyvenamumas buvo reikšmingai susijęs su glioblastomos morfoze (GBM) ir pacientais, sergančiais žemo laipsnio smegenų glioma (LGG) (5e pav.).Šie rezultatai rodo, kad DARS-AS1 gali atlikti svarbų vaidmenį klinikiniame naviko progresavime ir gali būti galimas nuspėjamasis daugelio vėžio atvejų biomarkeris.
Šiame tyrime, naudodamiesi didelio masto CRISPRi funkcine patikra, nustatėme, kad DARS-AS1 lncRNR įveikia vėžinių ląstelių stresą, reguliuodama du pagrindinius streso reagatorius PACT ir PKR.Tiesiogiai sąveikaudamas su PACT, DARS-AS1 slopino PACT sukeltą PKR aktyvaciją, taip užkirsdamas kelią apoptozinei ląstelių žūčiai ir skatindamas ląstelių proliferaciją (5f pav.).DARS-AS1 reguliavimas buvo pastebėtas sergant kelių tipų vėžiu, o tai rodo, kad jo funkcija skatinti vėžio ląstelių išgyvenimą stresinėmis sąlygomis gali būti plačiai taikoma daugeliui vėžio tipų.
PACT buvo nustatytas kaip PKR aktyvatoriaus baltymas, o PACT sukeltas PKR aktyvinimas vaidina svarbų vaidmenį reaguojant į stresą, reguliuodamas transkripciją, transliaciją, apoptozę ir kitus svarbius ląstelių procesus62.Dešimtmečius buvo bandoma suprasti vėžiui būdingą PACT-PKR kaskados reguliavimą.Čia mūsų tyrimas atskleidė skirtingą PACT-PKR reguliavimo mechanizmą vėžio ląstelėse per ląstelių lncRNR DARS-AS1, kuris tiesiogiai jungiasi su PACT, blokuoja PACT-PKR sąveiką, slopina PKR aktyvaciją ir eIF2α fosforilinimą, taip slopindamas streso sukeltą apoptozę ir skatinantis galimą vėžio plitimą.ląstelės.Šis atradimas atskleidžia galimus lncRNR tikslus vėžio prognozei ir gydymui.
Mūsų duomenys parodė, kad DARS-AS1 numušimas jautrina ląsteles serumo badui, žymiai padidindamas fosforilinto PKR ir eIF2α.Šie rezultatai rodo, kad DARS-AS1 skatina vėžio ląstelių išgyvenimą atšiauriomis sąlygomis, slopindamas PACT / PKR aktyvumą.Kai kurios kitos nekoduojančios RNR, tokios kaip ASPACT ir nc886, taip pat dalyvauja PACT / PKR ašyje, sumažindamos PACT48 mRNR arba reguliuodamos autofosforilinimą prisijungdamos prie PKR49, 50, 64.Tarp jų DARS-AS1 veikia kaip PACT-PKR asociacijos sutrikdytojas.Šis tyrimas praturtina mūsų supratimą apie PACT / PKR ašies reguliavimą ir lncRNR vaidmenį reaguojant į stresą.
PACT sudaro trys atskiri domenai.Kiekvieno iš pirmųjų dviejų dsRBD pakanka, kad būtų pasiektas didelis PACT prisijungimas prie PKR, o trečiasis domenas (D3) reikalingas PKR aktyvavimui in vitro ir in vivo.Mūsų tyrimas parodė, kad DARS-AS1 pirmiausia sąveikauja su D3 domenu (3h pav.).Atsižvelgiant į didelį lncRNR dydį (768 nukleotidai), DARS-AS1 prisijungimas prie D3 gali fiziškai slopinti sąveiką tarp dsRBD ir PKR PACT domeno, taip blokuodamas PACT ir PKR ryšį.PACT taškinės mutacijos, kurios D3 Ser246 ir Ser287 pakeitė alaninu arba aspartatu, sutrikdė jo jungimosi afinitetą su DARS-AS1, nurodydamos bendrų D3 struktūrinių ir elektrinių savybių svarbą jų sąsajoje.Ateityje reikės išsamesnės informacijos apie šį mechanizmą, naudojant tikslesnę biocheminę analizę ir didelės skiriamosios gebos PACT struktūrinę analizę.
Ankstesni tyrimai pranešė, kad DARS-AS1 skatina ląstelių dauginimąsi keliais mechanizmais51,52,53.Viename pavyzdyje tyrėjai pastebėjo, kad DARS-AS1 padidino savo antisensinius baltymus koduojančius DARS genus, nukreipdamas miP-194-5p į inkstų vėžio ląsteles.Tačiau šiame tyrime DARS-AS1 numušimas turėjo mažai įtakos DARS transkripcijai sergant kelių rūšių vėžiu, įskaitant bent jau gaubtinės ir tiesiosios žarnos, krūties ir kepenų vėžį.Kadangi lncRNR pasižymi ląstelėms ir audiniams būdingus ekspresijos modelius, funkciniai mechanizmai gali būti neišsaugoti įvairių tipų vėžio, o tai gali prisidėti prie šio neatitikimo tarp mūsų stebėjimų ir ankstesnių skirtingų vėžio vertinimų.Norint išsiaiškinti specifinius įvairių fiziologinių ir patologinių procesų mechanizmus, reikalingi specialūs tyrimai.
Klinikinių duomenų analizė parodė, kad DARS-AS1 ekspresija navikuose yra atvirkščiai koreliuojama su vėžiu sergančių pacientų išgyvenimu, o tai pabrėžia DARS-AS1/PACT/PKR ašies svarbą vėžio prognozėje.Apibendrinant galima pasakyti, kad mūsų tyrimas rodo, kad DARS-AS1 yra PACT / PKR signalizacijos ašies reguliatorius, skatina vėžio ląstelių dauginimąsi ir slopina apoptozę reaguojant į stresą, o tai yra dar viena tyrimų kryptis ir yra įdomi būsimiems galimo gydymo tyrimams. .
Žmogaus ląstelių linijos SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 ir HEK293T buvo gautos iš Kinijos nacionalinės ląstelių linijos išteklių infrastruktūros.Visos ląstelės buvo laikomos DMEM terpėje (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), papildytoje 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) ir 1% penicilino-streptomicino (Thermo Fisher Scientific) 37 °C temperatūroje, 5% CO2.inkubatorius.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (fosforas S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosforas S246), agentas (AP7744b);anti-β-tubulinas, CST (2128);normalus pelės IgG, CST (5415S);normalus triušio IgG, CST (2729S).Antikūnai buvo atskiesti 1: 1000 PBST Western bloting ir 1: 100 IP.
sgRNR buvo sukurtos naudojant viešai prieinamą įrankį CRISPR-ERA66.Mes naudojome numatytuosius įrankio parametrus sgRNR vystymui ir algoritmą apskaičiavome sgRNR surišimo vietas 3 kb srityje.sutelktas į TSS.SgRNR oligonukleotidų telkiniai buvo susintetinti CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) ir klonuoti į humanizuotas pgRNR plazmides (Addgene #44248).Iš viso 12 µg sujungtos humanizuotos pgRNR plazmidės, 7,2 µg psPAX2 (Addgene #12260) ir 4,8 µg pMD2.G (Addgene #12259) buvo kartu transfekuoti į 5 x 106 HEK293T indelius DNR Transfecta cm ląstelės (CWBIO, Pekinas, Kinija) pagal gamintojo nurodymus.Viruso turintys supernatantai buvo surinkti praėjus 48 ir 72 valandoms po transfekcijos ir filtruojami per 0, 45 µm filtrą.Atrankai SW620 ląstelės, ekspresuojančios dCas9 / KRAB sulietą baltymą, buvo gautos viruso transdukcija.Modifikuotos SW620 ląstelės buvo užkrėstos virusų biblioteka keturių nepriklausomų infekcijos eksperimentų metu, kai MOI buvo 0,1–0,3, ir 2 dienas buvo imami 2 μg/ml puromicino (Sigma, St. Louis, MO) mėginiai.Po to ląstelės buvo kultivuojamos 18 dienų in vitro su minimaliu bibliotekos aprėpimu 500 ląstelių / sgRNR atrankai.
Genominė DNR buvo išskirta pagal QIAamp DNA Blood Midi rinkinio (QIAGEN, Diuseldorfas, Vokietija; 51183) instrukcijas.Iš viso bibliotekai sukurti buvo panaudota 100 μg genominės DNR vienam biologiniam pakartojimui.SgRNR sritis buvo sustiprinta dviem PGR etapais ir susieta su brūkšniniu kodu.
PGR produktai buvo išgryninti naudojant NucleoSpin® gelį ir PGR gryninimo rinkinį (MACHEREY-NAGEL, Düren, Vokietija; 740609.250) ir kiekybiškai įvertinti naudojant Qubit™ HS dvigrandę DNR aptikimo rinkinį (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Ląstelių proliferacijai matuoti buvo naudojamas MTS tyrimas.Ląstelės buvo pasėtos į 96 šulinėlių plokšteles, kurių pradinis tankis buvo 2000 ląstelių / duobutėje.Santykinis ląstelių skaičius buvo matuojamas kasdien nurodytu laiku iš viso 4–6 dienas.Kiekviename šulinyje 20 μl MTS reagento (Promega) buvo praskiesta 100 μl DMEM, inkubuojama su ląstelėmis 4 valandas 37 ° C temperatūroje, tada buvo išmatuotas OD490.
Neįtvirtinto augimo galimybė buvo atrasta išanalizavus sferų susidarymą.Trumpai tariant, 2000 ląstelių, transfekuotų shRNA DARS-AS1 arba kontroline shRNR, buvo kultivuojamos itin žemo pritvirtinimo mikroplokštelėse (Corning), keičiant terpę kas 4 dienas.Sferoidai buvo suskaičiuoti po 14 dienų.Stiprinimo tyrimui buvo panaudota 500 ląstelių, transfekuotų DARS-AS1 ekspresijos plazmide arba kontroline plazmide, kitu atveju metodas nepasikeitė.
RNR buvo transkribuota naudojant T7 RNR polimerazę ir biotiną-16-UTP (Roche 1138908910) pagal Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440) instrukcijas.Čia naudojami gruntai yra išvardyti 4 papildomoje lentelėje.
Baltymus koduojantys PACT arba PKR regionai buvo klonuoti į pET15b (Addgene #73619) ir transformuoti į BL21(DE3).Bakterijos buvo inkubuojamos per naktį LB, tiekiamas ampicilinu, o po to 100 kartų praskiestas šviežiu LB.Kai terpės OD600 pasiekė 0, 8, baltymų ekspresijai sukelti buvo pridėta 1 mM IPTG.Po inkubacijos per naktį švelniai purtant (250 aps./min. 20 °C temperatūroje), ląstelių nuosėdos buvo surinktos centrifuguojant (4000 aps./min., 10 min., 4 °C).Ląstelių nuosėdas pakartotinai suspenduokite lizės buferyje (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) ir inkubuokite ant ledo 30 min., tada apdorokite ultragarsu (15 min., 5 s įjungimas/išjungimas, ant ledo) ir centrifuguokite (13 000). aps./min.)., 30 min., 4°С).Tada supernatantas buvo įdėtas į Ni-NTA dervą (QIAGEN) 3 kartus 4 °C temperatūroje, 4 kartus plaunamas plovimo buferiu (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM imidazolo, 250 mM NaCl) ir eliuuojamas 3 kartus, iš viso 10 ml eliuento buferio (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazolo).Išgrynintas baltymas buvo nustatytas naudojant WB, o koncentracija buvo nustatyta naudojant Qubit™ baltymų tyrimo rinkinį (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
RIP tyrimai buvo atlikti, kaip aprašyta anksčiau, su pakeitimais.Trumpai tariant, 1x RIP buferis (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, RNazino ribonukleazės inhibitorius (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, proteazė) lizuoja citostatinį 10 kokteilį 1 x (Roche, 1 mM DTT) ir centrifuguokite 13 000 aps./min. greičiu 15 min. 4 °C temperatūroje.Tada supernatantas buvo inkubuojamas su baltymų A + G magnetinėmis granulėmis (Millipore), konjuguotomis su 5 μg anti-PACT antikūnų (Abeam) arba IgG (CST).Karoliukai buvo plaunami 5 kartus su 5x RIP buferiu, tada virškinami proteinaze K (NEB).RNR buvo ekstrahuota Trizol ir nustatyta RT-qPCR.Gruntai pateikti 5 papildomoje lentelėje.
In vitro RIP tyrimas buvo atliktas pagal modifikuotą standartinį RIP tyrimo protokolą.Iš viso 5 pmol in vitro transkribuotos RNR buvo praskiesta 1 kartą RIP buferiu ir atkaitinta inkubuojant 65 ° C temperatūroje 5 minutes, po to lėtai atšaldant iki kambario temperatūros.Iš viso iš E. coli buvo išgryninti 5 pmol nepažeistų arba mutavusių vėliavėle pažymėtų PACT baltymų.Inkubuokite su renatūruota RNR 2 valandas 4 °C temperatūroje ir atlikite pirmiau nurodytą RIP analizės procedūrą, skirtą anti-flag IP analizei.
RNR pratęsimo analizei 1 × 107 ląstelės buvo lizuojamos 1xRIP buferiu.Po centrifugavimo 13 000 aps./min 15 minučių 4 ° C temperatūroje, supernatantas buvo iš anksto apdorotas 30 μl streptavidino magnetinių granulių (Beckman) 2 valandas 4 ° C temperatūroje.Išgrynintas lizatas buvo tiekiamas su mielių tRNR ir inkubuojamas su 40 pmol renatūruotos RNR per naktį 4 ° C temperatūroje, tada dar 2 valandas ir pridėta 20 μl naujų streptavidino magnetinių granulių, užblokuotų BSA.Skalbimo etapas susideda iš 4 kartų su 5x RIP buferiu ir 4 kartus su 1x RIP buferiu.Atitinkami baltymai buvo eliuuojami biotino eliuavimo buferiu (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-biotinas, PMSF) ir atskiriami NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Po dažymo sidabru (Beyotime Biotechnology), tam tikros juostos buvo iškirptos ir išanalizuotos MS.
PACT ir PKR sąveikai patikrinti buvo atlikta bendra IP analizė.Trumpai tariant, supernatantų lizatai buvo paruošti inkubuojant 1 x 107 lizuotas ląsteles 1 x RIP buferyje, po to centrifuguojant 13 000 aps./min 15 minučių 4 ° C temperatūroje.Lizatai buvo pakrauti su baltymų A + G magnetinėmis granulėmis, konjuguoti su 5 µg anti-PACT antikūno ir švelniai sukti per naktį 4 ° C temperatūroje.Karoliukai buvo plaunami 3 kartus 5 × RIP buferiu, du kartus su 1 × RIP buferiu ir eliuuojami 1 × SDS buferiu.Išgautas baltymas buvo analizuojamas SDS-PAGE geliu ir aptiktas WB.
Du pmol pažymėto PACT ir 1 pmol PKR buvo išgryninti iš E. coli.Praskieskite 1 × RIP buferiu ir inkubuokite su 10 pmol renatūruotos RNR 2 valandas 4 °C temperatūroje.Po to jie dar dvi valandas buvo inkubuojami su baltymų A + G magnetiniais granulėmis konjuguotu antikūnu, nepažymėtu.Tada granulės keturis kartus plaunamos 1x RIP buferiu ir eliuuojamos 1x SDS buferiu.Gautą PACT ir PKR aptiko WB.